【求助】我把图上下贴倒了，再帮我分析一下我的...

最新回复

• shenkunjie (2013-4-10 13:10:24)

  
  我认为需要透析除去尿素，降低尿素对受试动物的毒性，浓缩可以考虑PEG或者超滤的方法。试试看，祝好运！

• BUK (2013-4-10 13:10:47)

  不用除去尿素,直接作为抗原打就可以了,这么低的浓度不好浓缩了,一般的话,用超滤浓缩就可以了

• 987789 (2013-4-10 13:11:05)

  谢谢解答，能给具体说一下超滤浓缩和透析的方法吗？

• 987789 (2013-4-10 13:11:52)

  
  大家帮帮我，在150、200、500、1000mM这种情况的纯度下可以直接打多克隆抗体吗？我很长时间在做蛋白的表达和纯化，快郁闷死了，大家赶紧帮帮我！

• 阿司匹林 (2013-4-10 13:12:09)

  
  单抗还是多抗？多抗的话应该可以了，你可以将包涵体洗涤一下，然后进行纯化，纯度可能会要好些，或者再过一个凝胶过滤，应该完全可以将主要的杂蛋白分开。

• 987789 (2013-4-10 13:12:37)

  
  在上柱之前我用1M、2M、3M、4M的尿素洗涤过了，然后上柱。凝胶过滤是怎么操作的，能不能具体给我说说？太感谢你了。

• utt0989 (2013-4-10 13:13:02)

  你这是HIS标签做的纯化吧，你看你的蛋白在各个咪唑浓度下都有很大程度上的洗脱，而且纯度并没有随着咪唑浓度升高而明显提高，在8M尿素情况下，肽链应该是很延伸的，HIS标签应该暴露较好，蛋白吸附应该较好，但我感觉你的HIS标签被蛋白本身的空间结构给屏避了一些，使得它与NI吸附不牢，你要是有时间的话，把HIS标签换个末端结果可能会好一些。我非常理解实验不出结果的煎熬，我当时的情况和你的结果很象，我换了个末端结果一下就好了，蛋白在很高的咪唑浓度下才被洗脱，收率和纯度一下就上来了。
  　　如果没有那么多时间，我觉得你在50mM除杂后，1M一下洗脱下来，我看你的杂蛋白分子量和你目的蛋白分子量差得很大，不如浓缩后上胶过滤制备的样品纯度应该可以满足你免疫的要求。
  　　超滤很快，但设备相对要贵一些，要是用透析的话，那可真地很费时，有关PEG透析浓缩的帖子园子里有一些，你可以自己找找看。别急，会好的。

• NBA (2013-4-10 13:13:50)

  
  你的胶不是用23ug/ml的样品跑出来的吧？
  离心超滤也不是很贵，4000rpm的离心机就可以做。

• 987789 (2013-4-10 13:14:18)

  是这个浓度跑出来的呀。就直接放到4000rpm的离心机里离心就好了吗？能说得详细点吗？谢谢你！

• mimili_901 (2013-4-10 13:14:42)

  
  从你的胶来看,你的目标蛋白浓度应该要比23微克/毫升,这是肯定的
  凝胶过滤,你用superdex g-75的柱子
  浓缩的话，用超滤浓缩管用冷冻离心机离心浓缩，也可以用压力浓缩，主要是看你的样品体积大小，离心浓缩时间一般要长一些。

• 66+77 (2013-4-10 13:15:05)

  
  从你的胶来看,你的目标蛋白浓度应该要比23微克/毫升,这是肯定的
  凝胶过滤,你用superdex g-75的柱子
  浓缩的话，用超滤浓缩管用冷冻离心机离心浓缩，也可以用压力浓缩，主要是看你的样品体积大小，离心浓缩时间一般要长一些。

• 987789 (2013-4-10 13:15:21)

  
  我的图开始贴倒了，现在我把它转过来了，蛋白大小约80kd，上面的条带才是目的条带，大家理解错了，太对不起！

• c86v (2013-4-10 13:15:43)

  
  建议该类提问应有以下信息：
  1、Marker 分子量大小
  2、洗脱条件：A，层析介质，柱体积
  B，平衡缓冲液成分 平衡体积
  C、上样缓冲液成分，上样量
  D，洗脱液成分 ， 洗脱体积，洗脱速度
  E，电泳上样量
  有这些信息，可以解决洗脱效果不好的问题
  尿素和咪唑用离心超滤搞定，Millipore和Pull 从1000－50000Dalton 都有产品