【求助】请教：从包涵体中提纯蛋白

最新回复

• mickeylin (2013-4-10 13:17:15)

  
  要加尿素，加尿素的作用是使包涵体在变性的条件下进行纯化，纯化的效果会更好，如果你不采用含有8M尿素的buffer，会使包涵体因为变性剂浓度突然减小，而导致沉淀的产生。
  如果洗脱液不加尿素，同样需要透析，用用作免疫的buffer透析，因为洗脱液中含有高盐等杂质，不宜用作免疫。

• 101010 (2013-4-10 13:17:34)

  
  谢谢指点。再请教一个问题：洗脱buffer中没加尿素后洗脱下来的蛋白，透析需不需要进行梯度透析？如果需要一般做哪些梯度较好。

• mickeylin (2013-4-10 13:17:53)

  既然是没有加尿素，何来的梯度透析了，我想你想说的问题，应该是加尿素的透析把，一般以2个浓度单位为好。如果有脱盐柱的话，你可以直接过脱盐柱就可以了。

• abc816 (2013-4-10 13:18:10)

  
  要说明的是变性的蛋白在纯化时无论是平衡洗脱都需要加同样的变性剂，如果不加洗脱不下来蛋白，因为会沉淀到柱子上，而且洗脱的蛋白含变性剂上除盐柱也会可能沉淀出不来，所以还是透析最可靠。透析多换几次水就可以，最后应该得到的是沉淀。这也浓缩了样品，所以透析是最好的选择，我们一直都是这么做的。此外其实有变性剂直接免疫应该也可以，否则不溶解那不好注射。

• 穿越时空 (2013-4-10 13:18:34)

  我就直接用变性蛋白纯化后免疫的，其中含4M尿素，200－250mM咪唑还有磷酸氢二钠，Tris等。免疫效果很好（家兔和小鼠）。其实我也不想这样，实在是因为复性怎么也成功不了。

• superboy (2013-4-10 13:18:59)

  
  我想请教一个问题，我准备用Ni-NTA柱子纯化蛋白（带有6个组氨酸标签蛋白），首先要裂解细菌，说明书上说在变性条件下，直接加1ml含尿素的裂解液，室温下轻柔振摇1小时，就可以过柱纯化了；可有的人说要先用超声波把细菌裂解后，再加1ml含尿素的裂解液裂解包涵体，这样纯化效果好，不知道楼上的各位同仁有何看法，如果要用超声波，所加的裂解液是什么。

• skytree (2013-4-10 13:19:24)

  
  当然要先用超声波破菌后，再加尿素裂解液裂解包涵体了，如果要用超声波，裂解液一般用20mMTris-HCL、5mMEDTA,pH8.0的buffer，加溶菌酶反复冻融2次破菌效果应该更好一些。破菌后包涵体要洗涤，一般用含Trition x-100、低浓度urea的buffe洗涤，这样包涵体纯度会增加，也方便了后面的纯化工作。