【求助】从Trizol提取RNA的残留物中提取蛋白做WB

最新回复

• abc816 (2013-4-17 17:27:32)

  
  当时为了节省样品，我做过用Trizol提取RNA后用残留的部分提取总蛋白质的实验。我用的是invitrogen的Trizol，它的说明书上有提取蛋白质的方法。提总蛋白本来是要做WB的，不过由于时间关系没有做，不过说明书上说可以做。你可以尝试一下！祝你好运！！

• 木槿 (2013-4-17 17:27:53)

  我做过，可以的，效果还不错，蛋白还很纯

• vivian4123 (2013-4-17 17:30:15)

  
  谢谢各位的帮助，楼上的战友能不能把具体的步骤发给我呢？我在网上也找了些方法但是有些不明白的地方，以下是其中的几步。
  1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清。
  2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
  3.真空抽干蛋白质沉淀5～10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。
  我想问的是这样分离出的蛋白是不是就可以直接来做WB了还是要进行一些其他的处理，还有就是含0.3M盐酸胍的95%乙醇怎么配制。还希望各位战友赐教

• rxcc33 (2013-4-17 17:32:55)

  我做过，可以的，效果还不错，蛋白还很纯
  
  请问你的蛋白是怎么溶的？以及如何保存，我马上也要做，非常想了解，谢谢！

• greenbee (2013-4-17 17:33:19)

  同问，据说trizlo 提取的蛋白很难溶，不知是怎么解决的，我还想知道一般100mg组织抽提的蛋白需加多少SDS溶液溶解？？谢谢~~

• qhyu (2013-4-17 17:33:47)

  
  今天试着提了一次，蛋白提出后用1%SDS溶解发现很难溶。后来用了60°水浴并且反复吹打才完全溶解。也不知道提出的蛋白能不能用。明天去测蛋白浓度。再跑跑胶看看到时候再和大家分享结果。

• abc816 (2013-4-17 17:34:39)

  
  请问你提多少的组织或细胞，用多少SDS溶解

• avi317 (2013-4-17 17:35:01)

  今天测了下浓度用的400μl的1%SDS溶解液测出来的一个是2.78μg/μl一个是0.9μg/μl感觉不是很高等我哪天跑胶曝光了再和大家分享结果

• DDD (2013-4-17 19:02:06)

  
  请问你提多少的组织或细胞，用多少SDS溶解？

• 木槿 (2013-4-17 19:02:42)

  今天测了下浓度用的400μl的1%SDS溶解液测出来的一个是2.78μg/μl一个是0.9μg/μl感觉不是很高等我哪天跑胶曝光了再和大家分享结果

• jrwyyplt (2013-4-17 19:03:08)

  
  不好意思，几天没上网了。沉淀一般是没有问题了，主要是溶解那一步比较难，蛋白块越大越难溶解，建议在异丙醇沉淀之前，就把蛋白溶液分装成小分再进行沉淀，最后溶解的时候再放到一起。如果需要的量不大，也用不了几份。我一般每20mg组织最终用400ul 1%SDS溶解。溶解条件为水域50°，尽量用枪头把蛋白沉淀块捅开，使其面积最大。溶解后就可以-20度保存了。

• ququer787 (2013-4-17 19:03:43)

  今天试着提蛋白，发现了一些问题：
  1.每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇后是否要混匀。我在提的过程中发现加入异丙醇后两者是分层的。
  2.洗蛋白沉淀时，是否要涡旋使蛋白与洗液充分混匀。
  第一次做，没有经验，望做过的赐教，谢谢！

• 木槿 (2013-4-17 19:04:01)

  
  今天跑胶并曝光，β-actin道是跑出来了但是目的条带没有结果下次再改变调节试试吧。

• yjf1026 (2013-4-17 19:04:27)

  今天试着提蛋白，发现了一些问题：
  1.每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇后是否要混匀。我在提的过程中发现加入异丙醇后两者是分层的。
  2.洗蛋白沉淀时，是否要涡旋使蛋白与洗液充分混匀。
  第一次做，没有经验，望做过的赐教，谢谢！
  
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  答1：是要混匀的，轻轻混匀
  答2：在第一次离心沉淀的时候，你就会发现沉淀很实，沉淀洗涤过程中很难冲开，我一般就在里边泡一会儿，目的是去除有机溶剂。

• yjf1026 (2013-4-17 19:04:53)

  我做过，可以的，效果还不错，蛋白还很纯
  
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  我记得抽提RNA中是用氯仿抽提，离心后的上清用异丙醇来沉淀获取RNA的。所以不太明白大家为什么提到是用异丙醇来沉淀蛋白质的。或许我把原理记错啦？很希望你能从加入氯仿分层后开始写下提取蛋白的protocol分享给大家，能让我们少走些弯路，非常感谢！

• u234 (2013-4-17 19:05:19)

  我是把一个样本分成三份提的蛋白，沉淀洗涤的时候我用涡旋可以把管底的沉淀悬起来，但仍有一部分是贴在管壁上的，也做过对比就是在加异丙醇的时候没有混匀，一样有蛋白沉淀，只是沉淀的状态与混匀的不一样：混匀的是小块状贴于管壁，不混匀的是薄膜状贴于管壁，但不混匀的后面的洗涤用涡旋比较容易从管壁下来，这只是我的尝试，样本比较少

• u234 (2013-4-17 19:17:25)

  
  另外说一下，我提的蛋白很好容的，加入1%SDS后基本就都溶了，剩少量没溶的50度水浴很快就溶了，就做了一次，4个标本，后来又做了一次正离心的时候停电了，标本也拿不出来，没有做下去，后来就丢掉了！

• vera+ (2013-4-17 19:18:26)

  为什么没有人愿意耐心写一下过程给我这种未尝试的人学习呢？感谢愿意做的人！

• kuohao17 (2013-4-17 19:19:26)

  请问从Trizol提取RNA的残留物中提取蛋白， 这种蛋白用什么方法测的蛋白浓度？