【求助】 某磷酸化蛋白测试文献上都是先免疫沉淀后再上WB

最新回复

• ukonptp (2013-4-17 20:11:55)

  免疫沉淀后检测内参就不太可能了

• （cat） (2013-4-17 20:13:26)

  感谢，请问不能加内参的抗体是吧？为什么呢
  论文中WB没有内参能行么？如何说明自己的上样量相同呢

• ukonptp (2013-4-17 20:14:02)

  
  那就要看你的IP产物中有没有内参了

• flower-201 (2013-4-17 20:53:06)

  免疫沉淀后检测内参就不太可能了
  
  
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  免疫共沉淀，不需要加内参，只要保证最后一步WB的上样量保持一致即可以。
  免疫共沉淀的基本原理为：
  “用A蛋白的抗体去沉淀A蛋白，这时候沉淀下来的可能是A蛋白，也可能是A和其他蛋白的复合体。然后用B蛋白的抗体去检测沉淀下来的样品（WB），如果检测到B蛋白，就说明A蛋白和B蛋白是形成复合体的。”
  因为内参基本不会与蛋白A结合，所以就不可能检测到内参。

• ROSE李 (2013-4-17 20:53:44)

  IP只需要做一张Input的WB来替代内参的作用，一般是10~20%，视目的蛋白在总蛋白中的含量而定吧。

• （cat） (2013-4-17 20:54:28)

  免疫共沉淀，不需要加内参，只要保证最后一步WB的上样量保持一致即可以。
  免疫共沉淀的基本原理为：
  “用A蛋白的抗体去沉淀A蛋白，这时候沉淀下来的可能是A蛋白，也可能是A和其他蛋白的复合体。然后用B蛋白的抗体去检测沉淀下来的样品（WB），如果检测到B蛋白，就说明A蛋白和B蛋白是形成复合体的。”
  
  因为内参基本不会与蛋白A结合，所以就不可能检测到内参。
  
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  谢谢答复，我没做过IP，我看过流程图，大概的过程知道。我测的A蛋白应该是含量太低或者什么原因不能直接WB，我看的刊物都是先免疫沉淀下来，再WB半定量。
  如果前面免疫沉淀沉淀只加了A蛋白抗体，那沉淀下来的蛋白不会有ACTIN一类的内参的，为了在后面WB时有内参，我想问
  是否可以在前面免疫沉淀步骤既加入A蛋白抗体，也同时加入ACTIN的抗体，保证最后WB时有内参可测
  
  另外免疫沉淀与免疫共沉淀意思一样么？我理解免疫沉淀只是为了蛋白富集纯化吧
  
  免疫沉淀如何用INPUT做内参？

• kuohao17 (2013-4-17 20:54:58)

  
  cuturl('http://immunotech.dxy.cn/bbs/thread/2246876?keywords=%E5%85%8D%E7%96%AB%E6%B2%89%E6%B7%80%E4%BA%8E%E5%85%8D%E7%96%AB%E5%85%B1%E6%B2%89%E6%B7%80#2246876')
  
  cuturl('http://immunotech.dxy.cn/bbs/thread/10355010?keywords=%E5%85%8D%E7%96%AB%E6%B2%89%E6%B7%80%E4%BA%8E%E5%85%8D%E7%96%AB%E5%85%B1%E6%B2%89%E6%B7%80#10355010')

• orangecake (2013-4-17 20:55:24)

  为了指示用于免疫共沉淀的各样本细胞裂解液总蛋白的量是一致的。
  例如：你有3个细胞裂解样品，总蛋白浓度分别为30ug/ul，40ug/ul，50ug/ul，现在你准备用来做Co-IP的蛋白量为300ug，那么这三个蛋白的取样量就是10ul，7.5ul，6ul。为了证明你用于Co-IP的各样品蛋白取样量完全一致，你就要另外再取300ug的10~20%(30~60ug)来单独跑一个电泳，然后WB(用目的蛋白的抗体或者内参抗体)，这张图就叫Input，国外文献凡是涉及Co-IP的都有这个图的，你查看一下文献就知道了。

• （cat） (2013-4-17 20:56:00)

  QUOTE:

  原帖由 orangecake 于 2013-4-17 20:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  为了指示用于免疫共沉淀的各样本细胞裂解液总蛋白的量是一致的。
  例如：你有3个细胞裂解样品，总蛋白浓度分别为30ug/ul，40ug/ul，50ug/ul，现在你准备用来做Co-IP的蛋白量为300ug，那么这三个蛋白的取样量就是10ul，7.5ul，6ul。为 ...

  很感谢楼上几位回复
  终于明白INPUT了，感谢啊，感谢
  不过不做免疫共沉淀，是免疫沉淀，免疫沉淀一般也都有INPUT图？
  另外，我想问下，是否能在前面免疫沉淀时把目的蛋白和内参蛋白一块沉淀下来？它们本身肯定不是结合的，我是想前面加入目的蛋白抗体也加入目的蛋白抗体，看步骤应该是不可以，请问为什么呢

• qhyu (2013-4-17 20:56:23)

  
  请问input是用的原液吗，其他的上样用的是沉淀后的上样，我这样理解没问题吧，谢谢解答
  另外我做co-ip，B蛋白的WB做出来了，A怎么出不来？跑原液A液没做出来，不知道为什么？难道沉淀下来的不是AB的结合物吗？B怎么就能跑出条带呢，另外我也做了内参ACTIN的，也出来了，细胞核不应该有的?不知道是什么情况？O(∩_∩)O谢谢

• kswl870 (2013-4-17 20:56:43)

  
  大家好，我是新手，我刚做IP，用一种抗体拉我的蛋白，然后我还是用这种抗体做WB，发现膜上一片黑，但是我用另外一种抗体检测另外一种蛋白就挺好的，这是为什么呀？有谁能解答，多谢！