【求助】300kD蛋白western优化

最新回复

• wood533 (2013-4-18 16:56:40)

  大分子量WB主要难度在电泳上，孵抗体什么的和小分子量的没什么区别
  
  1 我来介绍一下我的经验，我做过400kd的蛋白，试过很多种方法，包括梯度胶等等，捣鼓了很久，最后发现一个简单的改变就可以轻松实现。
  1.将单叉和双叉的比例由1：29改为1：60，这将极大的增加胶联的孔径。
  2.分离胶用6%，浓缩胶4%，在剥胶的时候会发现胶非常的稀软，像鼻涕一样，但它毕竟是成型的，有一点耐心，小心的把它从板子上剥下来。
  3.电泳时间：选择分子量最大的预染MARKER，我用的是250kd，然后在电泳槽周围堆满冰，120ma使劲跑吧，跑两个小时换一次电泳液，一直跑到250kd的MARKER，离开胶释放到电泳液中，大概要用5个小时。这时候400kd的蛋白在离开浓缩胶边界0.5~1cm的地方。
  4.转膜：虽然湿转更好，但当时实验室只有半干转膜仪，于是加大电压1h，就OK了，时间再长就太热了。
  5.孵育抗体什么的都是一样的，但是建议蛋白上样量大一点，毕竟转膜不会转的很干净，会有损失的，而且大分子量的带一般不会很平齐，因为分子量大很多是由于糖基化修饰的缘故，每个蛋白不能保证都修饰的一模一样。
  
  这么做效果还是很好的，相关的文章已经在5分多的杂志发表了，希望可以解决的你的问题

• yes4 (2013-4-18 16:57:10)

  
  谢谢楼上阿,非常感谢
  还有一些小疑问
  5小时电泳会不会条带弥散阿?
  marker跑到电泳液里了,转膜的时候以什么作为标志呢?
  “跑两个小时换一次电泳液”换得是内液，外液呢？
  我实验室半干转膜仪的电压貌似不能调，只有9V，我在上面加冰袋，但是2h转完了以后膜和滤纸都很干，还有什么建议呢？
  转完膜我用丽春红染色就发现条带不是一般的弥散，整个泳道都是，是不是目的蛋白只有那么多，杂蛋白倒是都转上去了，转膜力度加强，封闭什么的用不用调整？
  呵呵，再次感谢
  很是困扰阿

• wood533 (2013-4-18 16:57:57)

  关于一些小疑问
  1.5小时电泳会不会条带弥散阿?
  不会，因为加了电压在的
  2.marker跑到电泳液里了,转膜的时候以什么作为标志呢?
  摸一下条件，转好了可以在膜上看到淡淡的蛋白泳道，也可以用丽春红染染，上样的蛋白量大，没转干净也能做出来。
  3.“跑两个小时换一次电泳液”换得是内液，外液呢？
  内液，全换也可以
  4.我实验室半干转膜仪的电压貌似不能调，只有9V，我在上面加冰袋，但是2h转完了以后膜和滤纸都很干，还有什么建议呢？
  半干转膜仪能压冰么？压在机器上？我没见过你的机器，不好理解，2H时间太长了
  5.转完膜我用丽春红染色就发现条带不是一般的弥散，整个泳道都是，是不是目的蛋白只有那么多，杂蛋白倒是都转上去了，转膜力度加强，封闭什么的用不用调整？
  转膜的蛋白是没有选择性的，不论目的还是杂蛋白都在上面，区分目的蛋白要靠抗体
  不客气，希望可以帮到你，呵呵

• rxcc33 (2013-4-18 17:11:00)

  可以先试一下点杂交

• wood533 (2013-4-18 17:11:37)

  
  谢了哈,现在终于显出300kD的条带了，虽然形状还不是非常美观

• bamboo16 (2013-4-18 17:12:01)

  
  大分子量的预染蛋白marker哪些公司有呀？推荐一下！谢谢！

• 66+77 (2013-4-18 17:12:47)

  
  cuturl('http://www.ebiotrade.com/newsf/2005-8/2005826170258.htm')

• 831226 (2013-4-18 17:13:28)

  这里面有最大250KD的 不知道有没有300kd的？

• wood533 (2013-4-18 17:14:11)

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• wmp1234 (2013-4-18 17:15:23)

  你的1：60的聚丙烯酰胺是在哪个公司买的？谢谢