【求助】WB在组织上能做出来，细胞里出不来，原因

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• NBA (2013-4-18 17:17:13)

  QUOTE:

  原帖由 douding66 于 2013-4-18 17:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我的WB在组织中貌似做出来了 在细胞中却好像做不出来 大家碰见过吗？什么原因？
  
  条件上：细胞样本：转膜 75V 恒压 4小时 OD测浓度3左右
  压片 5分钟左右可出现条带，杂带很多
  组织样本：转膜 250ma 2小时 OD测浓度10以上
  压片 1 ...

  只能是操作问题

• 00无名指00 (2013-4-18 17:20:15)

  可能和这个蛋白在组织和细胞中的丰度不同有关系。

• douding66 (2013-4-18 17:21:17)

  可能和这个蛋白在组织和细胞中的丰度不同有关系。
  
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  这个我想过 还是有可能的 但是3个细胞株都这样 还是有点诡异

• douding66 (2013-4-18 17:21:46)

  做出来带来了，只是杂带多么？抗体浓度高了,block浓度低了

• utt0989 (2013-4-18 17:22:11)

  多大分子量，转这么长时间？

• douding66 (2013-4-18 17:22:51)

  QUOTE:

  原帖由 utt0989 于 2013-4-18 17:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  多大分子量，转这么长时间？

  号称250-350KDA 所以转得比较长

• douding66 (2013-4-18 17:23:18)

  是做出来带来了，只是杂带多么？抗体浓度高了,block浓度低了
  
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  是这样的额 当单独做细胞样本时 抗体浓度低时（1:500） 压很久才有带（大概10几 20分钟） 应该是杂带 没目的条带
  抗体浓度高时(1:250) 压片时间可以缩短（5-10分钟） 杂带更多
  1:1000 时基本就是光板了
  
  用同样的蛋白，我做出了另外一个基因，内参也能做出来

• utt0989 (2013-4-18 17:23:52)

  
  你这时间不叫长呢，判断标准有问题哈。只是出来的带不错清晰，就是最佳的，因为上样量或样品表达量无法控制不是。怀疑你说的杂带或片不干净都是因为抗体太高的原因，抗体稀释后，压膜时间再长点看看。我一个蛋白，压膜50分钟，带非常清晰，片子也干净，OK，这是肝脏的，肾脏的，做了50分钟带还很淡的，组织特异性，想想清晰，需要更长的时间压片。做出来是硬道理。除了5分钟内的立等外，其它的，你该做什么做什么去就行了。

• douding66 (2013-4-18 17:24:25)

  QUOTE:

  原帖由 utt0989 于 2013-4-18 17:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你这时间不叫长呢，判断标准有问题哈。只是出来的带不错清晰，就是最佳的，因为上样量或样品表达量无法控制不是。怀疑你说的杂带或片不干净都是因为抗体太高的原因，抗体稀释后，压膜时间再长点看看。我一个蛋白，压膜50分钟，带 ...

  谢谢 这个可以试试 以前最长压过25分钟左右 抗体一直浓度比较高

• mickeylin (2013-4-18 17:24:59)

  
  我跟楼主相反，同一种蛋白细胞里能做出来，组织里做不出来，我提蛋白的方法肯定出错了
  还有我的分子量才33kd，我一直300mA 2个小时