【求助】转膜时34kd的marker总是很浅求告知原因

最新回复

• 冰儿0109 (2013-4-19 12:31:11)

  各位前辈，我最近做WB时发现，同样的10%的分离胶，以前可以分离到17kd，现在只能分到26kd了，不知道是啥原因导致的呢？试剂、PH值、电泳缓冲液都调过换过了，还是一样。另外，转膜的时候，34kd的marker总是很浅，而下面的26kd和上面的65kd都比较浓，条件一直都是恒压100v 50-60min，目的蛋白35kd左右。marker是Fermentas的SM0672，之前转膜的时候各个条带还是差不多深浅的，愿各位战友不吝赐教！非常感谢~
  
  [ 本帖最后由 冰儿0109 于 2013-4-19 12:33 编辑 ]

• NBA (2013-4-19 12:36:43)

  
  你是湿转的吗？电压真高，我半干转一般电压18V 1h ，Fermentas maker一般很好啊，另外告诉你一个小技巧，maker 和蛋白之间空一个空，结果就很好。呵呵

• viviwang1987 (2013-4-19 12:37:18)

  你们最近实验室的蒸馏水是不是更换过？要测试一下蒸馏水的pH，以前我们也曾经出现过这种情况：换过蒸馏水后，做的片子不如之前做的，就是pH值低于6了。

• taoshengyijiu (2013-4-19 12:37:42)

  电压过高，中间出现干燥界面造成的。
  转印时一般看电流，0.8毫安/cm2

• dream2013 (2013-4-19 12:38:06)

  
  我是100v，1.5-2h，什么都OK

• 冰儿0109 (2013-4-19 12:40:00)

  你是湿转的吗？电压真高，我半干转一般电压18V 1h ，Fermentas maker一般很好啊，另外告诉你一个小技巧，maker 和蛋白之间空一个空，结果就很好。呵呵
  
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  是湿转，哈哈，非常感谢！我试下~

• 冰儿0109 (2013-4-19 12:40:19)

  你们最近实验室的蒸馏水是不是更换过？要测试一下蒸馏水的pH，以前我们也曾经出现过这种情况：换过蒸馏水后，做的片子不如之前做的，就是pH值低于6了。
  
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  谢谢你的提醒！我稍后测测我们的蒸馏水的PH值，倒是没有换过，不过仪器也有脾气的嘛，这个保不准~谢啦！

• 冰儿0109 (2013-4-19 12:40:47)

  电压过高，中间出现干燥界面造成的。
  转印时一般看电流，0.8毫安/cm2
  
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  谢谢你的建议！但是我之前一直都是100v 湿转恒压的，效果还可以的。那如果还不行我就试试恒流转吧，谢谢！

• 冰儿0109 (2013-4-19 12:41:14)

  我是100v，1.5-2h，什么都OK
  
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  哇，转这么久啊，不会转过么？

• 00无名指00 (2013-4-19 12:41:35)

  
  100v,1.5-2h?我也觉得有点久，但是我现在做20以上KD的蛋白样品，条件基本稳定在湿转，300V，50min，0.45 nm PVDF 膜， 用的仪器是BIO-RED的，效果还可以。还有我做20KD-90KD之间的分离胶浓度一般用12%，希望能帮到你！

• hold住 (2013-4-19 12:42:04)

  
  我做15-150kd蛋白全是100v，1.5-2h，我大概看表，不是很精确，想起来了就不转膜了，全都OK的。我的marker 是BIO-RAD的DualColor，catalog：#161-0374，膜上清清楚楚的。转膜我是在冷房放着。

• hold住 (2013-4-19 12:42:24)

  如果我懒得一天完成转膜，我就50V转膜过夜，都OK的

• utt0989 (2013-4-19 12:42:43)

  
  12% gel，100v, 75-90min

• xingyi08 (2013-4-19 12:43:12)

  
  marker天带降解了吧

• xingyi08 (2013-4-19 12:43:28)

  第一问：母液浓度不对，或缓冲液PH不对，甚至ph计的问题、不准也是有可能的啊。。。

• 冰儿0109 (2013-4-19 12:44:01)

  我做15-150kd蛋白全是100v，1.5-2h，我大概看表，不是很精确，想起来了就不转膜了，全都OK的。我的marker 是BIO-RAD的DualColor，catalog：#161-0374，膜上清清楚楚的。转膜我是在冷房放着。
  
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  谢谢！我们这条件有限，没有冷房，考虑夏天塞冰箱里。。。

• 冰儿0109 (2013-4-19 12:44:22)

  第一问：母液浓度不对，或缓冲液PH不对，甚至ph计的问题、不准也是有可能的啊。。。
  
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  多谢帮助！貌似是APS的原因，之前的用完了配了新的，电泳时胶的下沿能到17kd了，转膜后marker也清晰了。囧。。。APS这么大影响力