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【求助】碧云天RIPA抽提细胞蛋白，14000xg,15...
碧云天RIPA抽提细胞蛋白，14000xg,15min离心后，上清液表面还有一层雾状的东西，是什么呢 ？【求助】碧云天RIPA抽提细胞蛋白，14000xg,15...
[ 本帖最后由 qiangren789 于 2013-4-19 13:30 编辑 ]
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最新回复
DDD (2013-4-19 13:05:23)
RIPA裂解细胞后，最好要超声破碎一下
那层雾状的东西是核酸
www.1 (2013-4-19 13:08:36)
脂肪类细胞？
加入裂解液后孵育没有？
caihong (2013-4-19 13:09:03)
gmjghh (2013-4-19 13:09:42)
高速离心还比水轻，强烈怀疑是油脂类物质，比如我们提取的神经组织的髓鞘等磷脂成分就是这样的。。
qiangren789 (2013-4-19 13:10:08)
显然是DNA，除非超声，用破碎细菌的强度大概２－３次，你说的成团的dd就没了。或者加适量DNA酶（一般的DNA酶都是100ugDNA＋１个单位，而细胞里的DNA的量却难计算吧，所以这个方法我后来就不用了）。
qiangren789 (2013-4-19 13:10:27)
那应该类似某种脂类的dd，你可以用枪头从伸到该液面以下吸（但是浪费比较多），不过呢，你也可以忽略它，我做过对照，对蛋白定量没什么影响（所以也判断不是蛋白）
qumm1985 (2013-4-19 13:11:05)
支持是脂质。
greenbee (2013-4-19 13:11:29)
芙蓉宫主 (2013-4-19 13:11:55)
LZ有做超声看过了吗
继续关注
langlang (2013-4-19 13:12:42)
我的也是，到底是什么呢？还有大侠知道吗？楼主怎么处理的啊？
zhezhe (2013-4-19 13:13:10)
大家都讨论是脂，可是没人考虑RIPA buffer的成分？
RIPA buffer里面含有1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，这些表面活性剂足够溶解一般细胞内的脂类。但是RIPAbuffer能溶解的细胞是有限的，看不同产品的说明书吧，多少细胞加多少的裂解液，其实多加一点无妨。我都是自己配置的，一般多加一些。
根据lz介绍的情况，我估计lz的细胞应该很容易成团吧？
lz在用RIPA 之前确认完全吹打分散了么？
如果完全分散了，很可能是lz加的细胞一次太多了，没有吹散就去煮沸了，然后就形成了絮状物，是SDS和其他细胞膜类形成的东西，煮沸以后已经无法再分离开这种东西了。
下次煮沸前超声一下,同样也可以考虑加一点DNAse。
yychen (2013-4-19 13:13:34)
我也的出现过这种情况，但是没有去管他，而且一样做出来了啊
3N4G (2013-4-19 13:13:53)
我用自己配的RIPA buffer提的果蝇幼虫的总蛋白，表面也漂浮着一层白色的东西，自我感觉像脂质，不过现在老是出现问题，western跑出来的带有明显的拖尾，不知道问什么？对照后证明是蛋白提取有问题，请高手们解释下原因：buffer如下：50mM Tris-Hcl,150mM Nacl,1mM EDTA,1% Triton-100,1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS,用前加1mM PMSF,冰上匀浆后，离心去上清。
3N4G (2013-4-19 13:14:12)
刚刚打错字了，是“离心取上清”
birdfish (2013-4-19 13:14:40)
我的蛋白提取后也这样的.
IAM007 (2013-4-19 13:15:12)
huifeng0516 (2013-4-19 13:15:33)
okhaha (2013-4-19 13:15:55)
肯定是脂肪,有的细胞脂肪含量高,比如lncap,不可能是核酸,因为dna如果能用肉眼看见,就肯定能离心下去,没有听说能看见dna还离不下去的
okhaha (2013-4-19 13:18:02)
建议保留脂肪,因为有些蛋白脂溶性强,丢掉可能同时丢掉蛋白
ROSE李 (2013-4-19 13:18:26)
我抽的细胞总蛋白，也有这些东西。 这些漂浮的脂类对做western有没有影响啊？
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