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【求助】western 问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-4-20 13:32    作者: PPT    来源: 分析测试百科网

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【求助】western 问题
我用western检测胰腺、肺、肾组织中NF-κB p65 的表达，但我不知道用什么样的裂解液，就高人指点，
我们实验室简陋，只能用匀浆器手动匀浆，
我现在用师兄以前用的western及IP裂解液提总蛋白，肺组织和肾组织提出来的蛋白都是红色的，是不是用什么问题啊，
会不会影响后面的操作
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  • cwcwcww (2013-4-20 13:32:33)


    有的时候变成红色是组织里面带有部分血液的成分，手动匀浆也可以，加入液氮后再匀浆，然后用裂解液效果也非常好的。

  • cwcwcww (2013-4-20 13:32:54)

    还有就是加入裂解液的量不要太多，否则蛋白浓度会降低。

  • am10 (2013-4-20 13:33:21)


    我一般是把组织冷冻在液氮中，把研钵放在-20度预冷，之后取出组织加入一定量的液氮在研钵中研磨成粉状。

    至于红色的问题是因为你取好组织后没有把组织在pbs中清洗干净，带有一定量的血液。

    希望可以帮到你

  • popo520 (2013-4-20 13:33:42)


    结合楼上的做法：
    把组织冷冻在液氮中，把研钵放在-20度预冷，之后取出组织加入一定量的液氮在研钵中研磨成粉状。
    将样品转入1.5ml 离心管。
    加入9M urea ( Tris 50 mM, pH6.8）， 体积大约为组织的10倍。
    漩涡混匀1分钟。
    将样品在液氮和水浴中反复冻融3次，
    （optional 超声破碎, 10分钟）
    漩涡混匀10分钟，常温。
    样品已经完成变性和溶解。
    离心， 大于10,000g， 3分钟， 常温.
    上清中为所获得样品，可测蛋白浓度，可做western blot 检测NF-κB p65 。

    本人可继续解答后续问题。

  • junjie05 (2013-4-20 13:34:10)

    结合楼上的做法。。。我们提组织蛋白尽量避免反复冻融，容易变性。。。而且离心尽量选4度的离心机，蛋白变性或变质了，在做标准曲线进行蛋白定量时误差会比较大。。。后面我附录一份我们实验室做wb的操作指南。。。希望对您有帮助。。。。。。嗯。弱弱提一句，偶是冲着丁当来的。。。嘿嘿。。。

  • junjie05 (2013-4-20 13:34:45)


    你可以试试这种Western blot 多用途液，很好用的。可以帮你节省很多的宝贵时间。
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