【求助】做WB遇到瓶颈，各位大神帮忙。

最新回复

• lxh031 (2013-4-20 13:36:59)

  
  蛋白分子量多少？
  内参蛋白有无条带？

• kuaizige (2013-4-20 13:37:22)

  
  改个二抗体系试试。
  稀释系列上样，免疫斑点法能否出现阳性系列斑点？

• dotaaa (2013-4-20 13:37:59)

  
  我的蛋白34kd

• dotaaa (2013-4-20 13:38:17)

  QUOTE:

  原帖由 lxh031 于 2013-4-20 13:36 发表
  
  蛋白分子量多少？
  内参蛋白有无条带？

  34kd
  内参目前没有用
  只是看看这个蛋白经过不同处理能不能出来‘
  但是貌似结果不是很理想

• dotaaa (2013-4-20 13:38:47)

  QUOTE:

  原帖由 kuaizige 于 2013-4-20 13:37 发表
  
  改个二抗体系试试。
  稀释系列上样，免疫斑点法能否出现阳性系列斑点？

  改二抗体系？是指稀释的配比吗？

• owanaka (2013-4-20 13:39:14)

  34kd,转膜2hour有点过了，可以1h或者75min

• junhun (2013-4-20 13:39:48)

  
  建议投诉一抗吧，如果转膜没问题，如果不放心，换0.22um的膜。

• flower-201 (2013-4-20 13:40:09)

  
  细胞不要直接裂解, 匀浆后充分离心

• S6044 (2013-4-20 13:40:40)

  本人做一个胞内表达蛋白，目前在做WB,具体的每一步如下：
  1 取细胞样离心（6孔板每个孔）加RIPA裂解液100ul 取80ul加5*loadingbuffer 20ul
  2 99摄氏度煮10min
  3 用1.5的板子做，上样量是40ul 100V 2小时
  4 转膜（湿转）：16V半小时+60V2小时 （转出来的膜预染marker挺好的）
  5 10%牛奶封闭 4摄氏度过夜 或者37摄氏度2小时
  6 一抗 5%牛奶TBST 4摄氏度过夜 37摄氏度2小时
  7 二抗 5%牛奶TBST 37摄氏度半小时
  8 曝光
  
  这个就是步骤 但是总是做不出来 请各位帮我分析一个原因 谢谢！
  
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  RIPA裂解！这么大的上样量！ marker预染挺好，那么细胞提取物预染效果如何？能看清条带还是一片smear？

• 算盘阿星 (2013-4-20 13:41:08)

  
  建议封闭时间一小时。。。封闭不要过夜。。换用5%的牛奶做封闭液。我以前封闭过夜就被老板骂了。。。说是封闭久了把一些正常蛋白应该结合的位点给占用了。。。。还有洗膜用的TBST液吐温的量降低、、、我以前用的千分之一的量。。有时候抗体效度不高时就很容易洗脱。。后来老板让改成千分之0.5.。。这样一般只要不是抗体有问题。。。一般不会做不出来、、、我是冲丁当来的、、、、我做western2年了。。。碰到好多问题。。。咱们可以交流下心得。。。。

• sr9971 (2013-4-20 13:41:40)

  
  你可以试试这种Western blot 多用途液，很好用的。可以帮你节省很多的宝贵时间。
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