【求助】SDS-PAGE条带上半部分清楚,下半部分弥散,为什么?

最新回复

• kulee (2013-4-26 17:32:25)

  
  跑非梯度的SDS-PAGE是可能出现这种结果的，不是蛋白降解的原因，在变性的时候，所有的蛋白应该都已经彻底解链打开了。这种情况可能是电泳时的电压偏低，在电泳前端的小分子量蛋白在向前泳动与自身扩散之间不平衡所造成的。将电压适当提高应该是可以解决。
  何谓浓缩胶聚合不好？？因为浓缩胶的浓度只有4－5%，因此，它凝固以后不会像分离胶那样那么有形，会有点像鼻涕一样烂乎乎的，这是正常的。样品在进入浓缩胶后是不会马上聚成一条细线的，只有在即将进入分离胶之前才会聚成一条细线。如果浓缩胶偏短，样品尚无法充分聚成一条线后就进入分离胶，这对电泳的结果会有一些影响，但个人认为不会太严重。

• abc816 (2013-4-26 17:32:52)

  我跑的就是9*10的小胶,觉得浓缩胶偏短.但是我需要的蛋白条带之一就是25KD的,这个区间的条带已经比较弥散了,不知后面做转膜和抗体杂交会不会影响?

• bring (2013-4-26 17:33:12)

  
  应该没有什么影响！我做western blot时的蛋白之一是26KD，效果还行！

• xyw5 (2013-4-26 17:33:35)

  不知道你是恒压还是恒流,如果恒压,是因为跑到最后电压太大,速度太快,而且散热太多造成的.如果恒流,是跑到最后,电压太小,造成速度太慢,条带弥散而成.所以你你应该调一下你的电泳条件.另外,试下在冰浴中跑,这样散热好些.其实SDS-PAGE最好的分离处在距顶部三分之二处,因为无论怎样,最后总会弥散,只是程度不同而已.你应该先计算一下胶浓度和你的蛋白分子量的关系,尽量把目的蛋白跑在最佳位置.

• mimili_901 (2013-4-26 17:34:56)

  最近一直在跑电泳,也来说两句
  以前跑的是SDS-PAGE，loading-buffer里含有2-ME和PMSF，发现跑带会出现溴酚蓝线不能形成很好的一条线的情况，最近跑NATIVE-PAGE，提取液和loading-buffer里只有蔗糖（甘油）+溴酚蓝+Trir-HCl，这样跑出来的溴酚蓝线就很平很窄了（即使上样量比较大），而且在浓缩较里就很快形成一条细线了。
  另外，我做的浓缩胶是3.33%的，也能成型的，关于你说的聚合的不好可以考虑下AP的问题，或者详细说说你的情况

• 2541 (2013-4-26 17:35:34)

  我们用的是恒流，小板每板开始在浓缩胶15mA，进入分离胶用20mA,也出现了高分子量带形较好，而低分子量区弥散，望指教！

• abc816 (2013-4-26 17:40:53)

  
  谢谢大家！我用的是恒压，浓缩胶80V，分离胶100V。的确跑到最后电泳槽比较热。下次我试试在冰浴中跑。另外，有没有人发现在胶聚合后拆封胶条时不太好操作，我经常会弄得两快玻板移位，产生气泡。不知大家有何高见？

• guagua (2013-4-26 17:41:17)

  
  胶板移位的原因多数是没有压紧，拆下来的时候动作要慢。我的胶跟你的差不多，胶的上半部分有模糊的带而下半部分没有带，只有甬道，我跑蛋白胶已经差不多有半年了，还是没跑出来，快急死我了。