【求助】影响western blot湿转效率的因素都有哪些？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-4-27 10:24 作者: PINK 来源: 分析测试百科网

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【求助】影响western blot湿转效率的因素都有哪些？

前不久，我们实验室western blot湿转的质量突然下降了，同样上的marker采用同样的转印电压、转印和以前一样的时间后，膜上转印的marker淡很多，蛋白的效果也不如从前，尤其是60kd左右的地方效果尤为不好。想了很多办法：换转印液、换新机器转印、换SDS，加长转印时间等等，都没有明显的提高，没有恢复到以前的状态，我们很困惑。
请问各位战友，有没有遇到类似的问题，如何能提高转印效率呢？

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最新回复

831226 (2013-4-27 10:24:29)

转膜前的配胶上样电泳每一步都会影响实验结果前阶段我们配胶配方如前但受温度影响胶易缩这就得注意上样量
duoduo (2013-4-27 10:25:00)

我认识的一个人他们实验室出现的情况和你们不太一样，就是跑胶以后发现marker特别淡，他们用的Tanon的系统，曾经报修过一次。怀疑是电泳仪的问题~~~
大白菜 (2013-4-27 10:25:26)

QUOTE:
原帖由 duoduo 于 2013-4-27 10:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我认识的一个人他们实验室出现的情况和你们不太一样，就是跑胶以后发现marker特别淡，他们用的Tanon的系统，曾经报修过一次。怀疑是电泳仪的问题~~~ ...
转膜液的配方贴过来看看
PINK (2013-4-27 10:26:27)

QUOTE:
原帖由 大白菜 于 2013-4-27 10:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

转膜液的配方贴过来看看

10*转印液配方（1000ml）：Tris 30.2g + 甘氨酸 144g 定容至1000ml

1*转印液：10*转印液200ml+甲醇400ml+dH2O定容至2000ml。
yes4 (2013-4-27 10:26:57)

1.配胶的SDS有没有问题
2.转膜的时候温度不能太高，我们用的和你的配方一样，没问题
any333 (2013-4-27 10:27:27)

1. 转膜温度一定要低，最好在冰上转；
2. 仔细检查下所用的转膜槽里面的金属铂丝是否断裂或接触不好，这会严重影响转膜质量。
daod (2013-4-27 10:27:47)

嗯，ls说的挺对的。
1. 检查仪器，这个可能性最大。可以借个别的实验室的好用的仪器对比试一下。
2. 冰转。或者低压在cold room转过夜。
3. 你们的甘氨酸可能需要换新的。这东西特容易过期。
4. 你们用的什么膜？PVDF膜需要浸methanol。
此外好像没啥别的了。
yes4 (2013-4-27 10:28:20)

曾经遇到类似的问题，不过最后转膜之前用methanol浸泡蛋白膜一分钟，转膜的效果就提高了很多，不妨试试
PINK (2013-4-27 10:29:29)

换了新的甘氨酸，PVDF膜是用甲醇激活，冰盒转印，温度控制的可以，有的人用了低压过夜转印，效率还是没有提高。
one (2013-4-27 10:30:05)

换了新的甘氨酸，PVDF膜是用甲醇激活，冰盒转印，温度控制的可以，有的人用了低压过夜转印，效率还是没有提高。

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我出现了和你一模一样的状况，请问你的问题解决了吗？
PINK (2013-4-27 10:30:24)

没有啊 marker还是很淡，感觉蛋白显像还可以
zsxan1990 (2013-4-27 10:31:11)

会不会由于激活pvdf膜的甲醇由于反复使用，浓度降低失效了。
yjf1026 (2013-4-27 10:31:50)

甲醇挥发了，重新配溶液。 SDS与蛋白质结合，有利于蛋白质从胶中迁移出来，但是与SDS结合的蛋白质很难与PVDF膜结合。甲醇可以去掉蛋白质上的SDS，有利于蛋白质同PVDF的结合，溶液用久了，甲醇挥发了。