【求助】内参有条带，目的蛋白无条带

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-5-07 15:10 作者: mingming0638 来源: 分析测试百科网

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【求助】内参有条带，目的蛋白无条带

我大概每次会做3-5个抗体，但是每次都是只有内参能显带，其他的抗体均未显带。并且：内参曝光1min即可显带，而曝光20min其余抗体对应的蛋白也不能出结果。
此外，如果Tween过期的话，是否会对实验结果产生明显影响？

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最新回复

9900 (2013-5-07 15:14:07)

tween没有明显影响，目的蛋白显不出原因很多，可能是丰度低、抗体不行等等。
am10 (2013-5-07 15:14:29)

内参能显带，说明实验用的试剂、操作应该没什么大问题，主要问题还是1.目的蛋白多大，电泳完是否还在胶里，或者多个目的蛋白是否能够充分跑开，2. 一抗问题，是否过期，或者特异性问题。请把问题说的详细些才好分析。
am10 (2013-5-07 15:14:48)

补充下：转膜过程也可能导致目的蛋白转过头，或者未完全转上。
mingming0638 (2013-5-07 15:15:09)

感谢各位的讨论！

我最多一次做5个抗体。分别为：22kD, 30kD, 45kD, 72kD, 90kD. 相对于45kD内参来说，其他蛋白的丰度都是低的。既然文献上是能做出来的，所以先不能以“丰度低”作为不出结果的主要原因。因为我只能做出来内参，其它四个均做不出来，我想也不至于丰度都低、抗体都有问题。至于转膜，我试过120V恒压1.5h、300mA恒流1.5h和120mA恒流1.5h，这些条件均能做出内参且做不出其它蛋白。从这一点上看，“蛋白转过头或完全没转上”至少不应该同时发生在4个蛋白。

目前，我刚买了一瓶新的Tween-20，准备换了试试。要是还不出结果，我打算好好染染胶，看看电泳完是不是目的蛋白已经不在胶里了。

欢迎大家继续讨论！
wmp1234 (2013-5-07 15:15:29)

我最近也遇到这个问题，我的内参TUBLINE （分子量54）能做出来，但是目的条带AMPK和P-AMPK分子量62,怎么都做不出来。很是郁闷
zsxan1990 (2013-5-07 15:15:47)

转完膜封闭前可以用丽春红等可逆染色方法，染一下，
就可以判断转膜的效果了。
不过若是使用 PVDF 膜则慎用该方法。
ROSE李 (2013-5-07 15:16:24)

转完膜封闭前可以用丽春红等可逆染色方法，染一下，
就可以判断转膜的效果了。
不过若是使用 PVDF 膜则慎用该方法。

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求教：PVDF膜为什么慎用丽春红染色呢？
我用的就是PVDF膜，丽春红染色后可以清楚的看到内参（42kd）和目的蛋白（62kd）,但曝光时只有内参显条带且条带很漂亮，目的就是不出条带。
但第一次做时，目的蛋白是出条带的……这说明一抗是没有问题的啊
现在又做了好多次了，目的蛋白死活不出条带。。。
yychen (2013-5-07 15:17:17)

我最近也遇到这个问题，我的内参TUBLINE （分子量54）能做出来，但是目的条带AMPK和P-AMPK分子量62,怎么都做不出来。很是郁闷

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哪里的抗体？
JK.jon (2013-5-07 15:17:47)

你没有做做预实验看看吗？
把上样量，一抗浓度，加大试试。