最新更新主题

月度关注热点

【求助】WB暴光出现的问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-5-08 13:52    作者: 米西11米西    来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】WB暴光出现的问题
各位大虾,小弟最近开始做WB,摸了几次条件,现在胶的考染和膜的丽春红上都能看见我的目的条带,我的蛋白是38KD,用地5%的浓缩胶,12%的分离胶,转膜45分钟(湿转).我的一抗(1:1000)4度过夜,二抗(1:1000)室温3-5个小时,ECL发光2分钟,出现的情况是,一次只出来内参,3次暴出来的照片全黑,在暗室看见我的膜上面全是荧光,分不清有条带否.我的膜是0.45微米的.
请问各位大虾我的问题主要出在哪里,是二抗孵育时间过长,还是洗膜时间不够(我洗膜时间是10分钟,5分钟,5分钟).郁闷中,离毕业越来越近,实验一点进展没有,希望得到大家的帮助,再次感谢
查看完整版本请点击这里：
【求助】WB暴光出现的问题

我也来说两句 查看全部回复

最新回复

  • finger (2013-5-08 13:52:42)

    我有一个问题请教。我诱导了一个GST融合蛋白，准备做GST-pulldown，但小量诱导后出现两条明显的带（与对照相比），用GST beads纯化后也有两条带，其中一条的大小与我的目的条带一致，且两条带的浓度差不多。请问，这个问题我怎么解决？我能否往下做GST-pulldown吗？
    先谢了！

  • avi317 (2013-5-08 13:54:19)

    几点建议供参考：
    1.转完膜后，胶考染没有目的带，膜用丽春红染目的带清晰，相应的预染marker条带滤纸上没有，则说明转膜比较充分
    2.“3次暴出来的照片全黑,在暗室看见我的膜上面全是荧光”可能与你的二抗浓度过大或洗膜不彻底（或洗膜液有问题）有关，可降低二抗的浓度并延长洗膜时间，如4×10mim，若你的洗膜液（PBST或TBST）放置久了，或有沉淀了就要重配了
    3.适当减低一下曝光时间试试

  • remenb (2013-5-08 13:55:04)

    二抗浓度太大吧 时间太长吧 可以考虑考虑。。
查看全部回复 我也来说两句
查看完整回复请点击这里：
【求助】WB暴光出现的问题