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【求助】p-p38的western

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-5-08 13:57    作者: free    来源: 分析测试百科网

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【求助】p-p38的western
做了一个月的磷酸化p38，买的CST的抗体。
只有一次一抗1：500，二抗1：1000出了很不清楚的条带。重复就再也没有了。
别的时候什么也没有。郁闷哪。
每次取新鲜标本，提取蛋白（加入磷酸酶抑制剂），上样量50，100，150，200ug。
电转200mA 2h，5%脱脂奶粉封闭1h。1：500，1：1000，二抗1：1000，1：6000都试过了。
就是不行。
求高手指点啊！
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最新回复

  • am10 (2013-5-08 13:58:05)

    用的是什么孔径的膜？蛋白分子量多大？是不是电转时间太长了？

  • free (2013-5-08 13:58:26)

    普利莱的NC膜，0.2 µm孔径
    200mA ，2h p38做出来了 ，但是p-p38就是不行
    请高手指点。

  • seven7 (2013-5-08 13:58:46)

    磷酸化抗体封闭液一般用BSA，你试一下10%BSA，再做不出来，拿过来我们给你做做看

  • wsll (2013-5-08 13:59:17)


    我的也是呢，做P-p38很久了都没有出来，1：500CST的抗体总是很弱，并且有很多杂带，真不知道该怎么优化，急求解决方法

  • is2011 (2013-5-08 13:59:43)


    还是建议你先用anti-pY抗体富集后再做磷酸化p38的WB， 效果会好很多的， 只是你的细胞培养多一点好用于富集。
    南宁蓝光生物（cuturl('www.bl-biotech.com'))有很不错的anti-pY Agarose,是共价结合的抗体，不易脱落所以抗体干扰比较少。

  • redbutterfly (2013-5-08 14:00:10)

    听说做磷酸化蛋白的时候，封闭尽量不用奶粉，而用BSA来封。
    200mA转膜两小时，这个时间稍微有点长，有转过头的可能。P-p38的分子量只有38kDa左右，不需要转这么长时间。我一般转50min就停了。不知道你做的几次实验结果如何，有没有背景，有没有杂带？如果没背景没杂带的话，可以考虑再增加抗体的浓度或增加上样的量来进行调整。NC膜结合能力比较弱，洗膜切记不可洗太长时间。
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