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【求助】肠激酶（EK）酶切后有俩个his标签怎么办？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-5-08 14:56    作者: damingxia0904    来源: 分析测试百科网

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【求助】肠激酶（EK）酶切后有俩个his标签怎么办？

各位同仁，我最近在做蛋白表达，用的是PET-32a载体，设计的目的蛋白插入在Nco I 和EcoR I之间，无终止密码子，原本计划BL21（DE3）表达后用肠激酶酶切，过his柱获得纯化目的蛋白，结果突然发现肠激酶切后另一部分蛋白上也有his标签，这样子的话是不是过his柱时两个蛋白片段都要跟柱子结合？那我怎么才能得到我要的目的蛋白呢？急啊，求助各位给予指点啊！
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  • 8princess8 (2013-5-08 14:56:34)


    可以用离子交换或者分子筛分开

  • 8princess8 (2013-5-08 14:56:59)

    如果你的蛋白和肠激酶大小差很多的话分子筛很容易分开

    如果大小接近，pI有差别的话可以用离子交换，建议用目标蛋白的pI过柱，这样肠激酶和切下来的标签挂柱，目标蛋白流穿。

    如果大小和pI都不行的话还有疏水层析等方法候补

  • yonger (2013-5-08 14:57:30)


    只要不是用的PET32b就行，由于移码，只有PET32b表达出来是带HIS标签的

  • windy+++ (2013-5-08 14:57:48)


    肠激酶就是一个渣渣，特异性很差的
    我建议你选择另外的载体重新做吧，不然到后面有你难受的

  • finger (2013-5-08 14:58:11)

    QUOTE:

    原帖由 windy+++ 于 2013-5-8 14:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    肠激酶就是一个渣渣，特异性很差的
    我建议你选择另外的载体重新做吧，不然到后面有你难受的
    我也碰到这个问题，肠激酶切后，目的蛋白被降解严重，哎，怎么解决呢，低温 会不会提升它的酶切特异性呢
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