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【求助】免疫共沉淀难题
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本人检测flag－A蛋白与myc－B蛋白之间的相互作用，使用sigma的anti－flag M2（mouse）抗体偶联的beads（20ul-40ul均用过）去IP 共转flag－A和myc－B的lysate中的flag－A蛋白，anti－myc（rabbit）抗体检测myc－B蛋白，阴性对照是单转myc－B蛋白的lysate，在用少量lysate时（200ug总蛋白）得不到myc－B条带，而用大于400ug的lysate时出现相互作用的条带，但阴性对照也有条带，有时比阳性ip条带浓，有时比其淡，但ip下来的A蛋白在阴性对照中都有的，即把Aip下来，一般都能检测到B蛋白。
这很容易联想到我时wash buffer不够厉害，但是我换了好几种buffer试试，都是得不到稳定结果要不全没有，要不全有。wash buffer的选择有什么窍门么？洗的时候也需要什么技巧么？
另外这种偶联beads的抗体是不是也很灵敏？多了就非特异吸附目的蛋白，少了就检测不到，说明书上推荐40ul，我后来觉得可能是过多了，改成30ul，20ul都试过，但是还是不稳定。
最后我要强调的是我最开始做出来过，但是因为input少了一个对照，后来就一直重复不出来了。现在老板也在催，自己也急，有些闹不明白了，怎么做都不搞不清楚了，请哪位做过ip的大侠指点指点一下丫！！！
方法与材料：
293T cell line
RIPA buffer（ lysis buffer）
TBS(containing 0.5 Tripton x－100）（wash buffer）
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最新回复
veiwu (2013-5-10 17:38:50)
我也很关系CO-IP的问题，感觉这个实验很不稳定阿，时有时无，而且杂带很多阿，清链和重链的条带都很重啊，你的实验里有吗，是很干净的就是目的条带吗？
dongdongqiang (2013-5-10 17:39:06)
我也遇到了同样的问题，我用的是SIGMA的myc偶联的珠子，请问大家有没有好的解决方法?
JK.jon (2013-5-10 17:39:23)
我用的是invitrogen的protein A beads，100ul的，阴性对照和实验组都有条带，但阴性对照会淡些，我师姐也做了很多，也是这样，没有阴性对照全无的，应该是预清除时的问题
dongdongqiang (2013-5-10 17:39:46)
QUOTE:
但是我用的是抗体和珠子预先偶联在一起的柱料，没有办法做预清除，不知道大家有没有更好的洗涤buffer的配方，减少这样的非特异结合。cocacola (2013-5-10 17:40:13)
CO-IP经常是不稳定的，尤其结合不是非常强的蛋白，经常会出现楼主说的情况，主要注意的问题就是洗的BUFFER，如果每次阴性都出来的话可以加大TRITON-X-100或者NP-40的浓度，比如从0.5－1％等不同浓度，洗的时候一定要注意珠子都被buffer冲起来，并且摇晃几次。其次要注意蛋白的表达情况是否都差不多，经常是阴性对照的蛋白表达较多，因此更容易被沾染。
youyou99 (2013-5-10 17:43:11)
我用的是invitrogen的protein A beads，没有偶联抗体，在蛋白收集好后，先和protein A beads 混合摇过夜，即预清除，wash buffer用的是PBS不含TRITON-X-100或者NP-40,阴性对照都会有条带，蛋白表达量在阳性组和阴性对照组差不多，用53蛋白和大T抗原做CO－IP也是这样，阴性对照也有条带，做了很多遍仍然这样，现在郁闷得很，不知道该怎么做。请高手指点迷津！！！
还有没有偶联抗体的beads和有偶联抗体的beads有什么区别？谢谢指导！
tangxin_80 (2013-5-10 17:44:26)
finger (2013-5-10 17:44:57)
greenbee (2013-5-10 17:45:15)
楼主，我最近CO-IP也遇到类似的问题，请问你最后是如何解决的？
remenb (2013-5-10 17:45:33)
Lysis buffer很关键
1.不能破坏相互作用，
2.不能影响抗体Pull down
一般Lysis和wash用同一种buffer比较好
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