【求助】 western blot奇怪现象，盼高人分析原因！

最新回复

• dragonkilly (2013-5-10 17:52:59)

  补充一下：我的beta-actin条带很清晰

• summerxx (2013-5-10 17:53:15)

  
  是否可以加大抗体的浓度,缩短洗膜的时间看看是否会好点

• kswl870 (2013-5-10 17:53:43)

  
  1、“对照组目的蛋白表达量低，我的上样量不够”，这么分析还是有点道理的，但是即使增加上样量，我感觉增加5倍都是上限了，所以还是感觉你的样品处理有问题，比如铺板时的细胞数目（如果是细胞试验的话）、细胞收集有问题、蛋白提取过程等等；我感觉你WB的过程问题不大！
  2、30mg的上样量，是不是单位写错了呢？你的蛋白浓度是多大呢？很吓人的！但是你这样做，总蛋白才增大了一倍，问题是解决不了的！
  3、“两个目的蛋白的一抗都是abcam的”，这句话一点意义都没有！其实你完全可以把你的目的蛋白告诉大家，看看别人用过的抗体哪个公司的最好用！感觉dxy的人还是很热情的！
  4、“曝光时间也延长到3小时”，这就更没有必要了，这么长的曝光时间，估计别人都没办法用仪器了，我做ECL的时候曝光时间控制在10min以内，没什么科学根据，就是自己的一种习惯吧！
  5、to楼上，增大抗体的浓度，我感觉没意义。我一般是按照抗体说明书上的稀释度，或者稍微低一点，该出来的就出来了，不该出来的，也还是出不来！

• 831226 (2013-5-10 17:54:10)

  
  值得你考虑的问题反问下你：
  你的对照组模型中，真的有目的蛋白的表达吗？或者本身这个蛋白的表达量就很少？这个你必须通过相关论文或自己着手验证下。既然模型组和对照组的差很明显看出来的话，你又何必追求对照组的条带呢。
  另外，在楼主的情况下，绝对不是抗体用量或者是曝光的问题。
  祝你实验成功！

• fei1226com (2013-5-10 17:54:55)

  同意楼上100ml的观点
  补充一点，楼主是不是做的是小分子蛋白，转膜的时候有没有问题呢？

• dragonkilly (2013-5-10 17:55:24)

  
  感谢楼上各位的回答！我现在上样量是100ug（单位我开始弄错了），我做的nox2（65kd），ucp2（33kd），现在还是对照组不出来。转膜是200ma恒流1小时，pvdf膜。盼各位再给点意见！谢谢！
  是不是可以不封闭？直接孵一抗。

• dragonkilly (2013-5-10 17:56:15)

  
  补充一下：我查过文献对照组ucp2表达是很低，文献上的图片对照组若影若现的。

• chenshuanhe (2013-5-10 17:56:39)

  
  你的beta-actin 条带清晰， 证明你的方法没什么问题，
  实验组有不太清楚的条带，对照组看不到条带
  有可能：
  1） 抗体浓度没有优化好，建议查下文献或者问下周围的人用的浓度
  2） 转膜时间不够，造成抗原量不够！建议尝试下增加转膜时间
  3）蛋白本身表达量就很低，建议用 原位斑点免疫杂交试一试,看看你的蛋白液中是否有抗原，如果有，那就可以尝试提高上样量，或者改用 SABC法来提高灵敏度！！
  Good Luck！

• kuaizige (2013-5-10 17:57:44)

  
  普通SDS-PAGE结束后考染是否在预期分子量附近有条带村在

• junhun (2013-5-10 17:58:29)

  
  请问你做后怎么做的，我在做ucp2，一直出不来啊