【求助】一种蛋白和KLH用戊二醛做偶联剂怎样进行偶联？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-5-18 10:29 作者: =pkchen= 来源: 分析测试百科网

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【求助】一种蛋白和KLH用戊二醛做偶联剂怎样进行偶联？

我现在需要做一种分子量大约1万多的蛋白质和KLH的偶联，用戊二醛做偶联剂，因为以前没有做过相关方面的东西，而且材料不多，只有10mg多点，怕做不成功浪费了。想请教一下大家：戊二醛应该用多大浓度多少量合适？文献中有的说将KLH溶于甘油，有的溶于PBS中，到底哪种更好些呢？蛋白和KLH的配比大概是多少？很着急，在此先谢谢大家了！

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最新回复

tuuu2 (2013-5-18 10:32:16)

如果没直接的可参考别的蛋白偶连的文献,或发到免疫版问问.也可看看免疫实验书中抗原制备.
star#room (2013-5-18 10:46:00)

KLH容于PBS就可以，本身是大分子蛋白杂和，水溶性非常好
戊二醛估计也可以用
不过最好还是用分子量长一点的link，这样免疫效果会好一点
INK (2013-5-18 10:46:22)

KLH水溶性不好吧！分子量太大了，不过还是溶解在PBS中比较好。楼主你这样直接用戊二醛偶联因为没有专一性，蛋白之间任意偶联，会形成多种产物，必须得过柱。建议先将蛋白修饰一下再偶联，可以考虑用SMCC。
star#room (2013-5-18 10:46:56)

QUOTE:
原帖由 INK 于 2013-5-18 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

KLH水溶性不好吧！分子量太大了，不过还是溶解在PBS中比较好。楼主你这样直接用戊二醛偶联因为没有专一性，蛋白之间任意偶联，会形成多种产物，必须得过柱。建议先将蛋白修饰一下再偶联，可以考虑用SMCC。 ...
PBS难道不是水溶性？
=pkchen= (2013-5-18 10:47:14)

我主要是要以这种分子量是一万多的蛋白质做抗原，因为它的抗原性比较弱，所以先和KLH偶联。请问这个怎么做才好？
greenbee (2013-5-18 10:47:49)

QUOTE:
原帖由 INK 于 2013-5-18 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

KLH水溶性不好吧！分子量太大了，不过还是溶解在PBS中比较好。楼主你这样直接用戊二醛偶联因为没有专一性，蛋白之间任意偶联，会形成多种产物，必须得过柱。建议先将蛋白修饰一下再偶联，可以考虑用SMCC。 ...
KLH的水溶性非常好，完全可以用水溶解，但建议溶解后一次使用完，如有剩余可以分装后置于-80度冰箱中。建议用SMCC效果很好。
star#room (2013-5-18 10:49:29)

SMCC 一头是NHS一头是-SH

KLH上有NH2-要用掉NHS-

楼主的抗原不一定带-SH，所以不能用SMCC

SMCC一般用在含Cystein（-SH）的多肽和KLH偶联

不过PIERCE也是有2头氨基偶联的linker

戊二醛么也可以试试，毕竟这个便宜。

btw：KLH有部分分子比你这个10000道尔顿的抗原还要大
star#room (2013-5-18 10:50:01)

你这个抗原分子和KLH差不多大，那偶联的时候1：1就可以了

或者KLH：抗原=2：1
plaa (2013-5-18 10:50:24)

我主要是要以这种分子量是一万多的蛋白质做抗原，因为它的抗原性比较弱，所以先和KLH偶联。请问这个怎么做才好？

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你是怎么知道它的抗原性弱呢？很奇怪！
分子量一万多不用连KLH了！
我觉得SMCC适合小分子，这么大的蛋白，你要确定有没有游离的巯基！
flower-201 (2013-5-18 10:52:17)

分子量大于10kD的蛋白质理论上都具有一定的免疫原性，不需要载体蛋白的偶联。KLH分子量非常大，可偶联的活性基团也多，通常作为载体蛋白，用于偶联多肽，制备抗体。像你这种抗原，直接免疫应该没有问题，如果抗体效价不高，可以尝试多种的注射方法（皮下多点注射、肌肉注射、淋巴结注射等等）混合免疫，以提高免疫效果。
greenbee (2013-5-18 10:53:30)

SMCC 一头是NHS一头是-SH

KLH上有NH2-要用掉NHS-
楼主的抗原不一定带-SH，所以不能用SMCC

SMCC一般用在含Cystein（-SH）的多肽和KLH偶联

不过PIERCE也是有2头氨基偶联的linker

戊二醛么也可以试试，毕竟这个便宜。

btw：KLH有部分分子比你这个10000道尔顿的抗原还要大

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用SMCC偶连时需要先将蛋白用TCEP还原出巯基即可。
ritou1985 (2013-5-18 10:55:20)

用SMCC偶连时需要先将蛋白用TCEP还原出巯基即可。

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这个还原后TCEP怎么去除呢?都说TCEP不参与马来酰亚胺反应可是好像不对啊...