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【求助】WB检测AMPK和P-AMPK总是做不出来

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-5-18 12:23    作者: 大脑门儿儿    来源: 分析测试百科网

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【求助】WB检测AMPK和P-AMPK总是做不出来

请各位大侠指教，最近做AMPK和P-AMPK得WB，AMPK和P-AMPK总是做不出来条带(TUBLINE条带能出来)。
一抗抗体是CELL SIGANL公司的。二抗用的是anti-mouse800.anti-rat700.最后条带扫描用ODYSSEY.
样本是小鼠骨骼肌，用的2%SDS裂解液（10mM Tris-Hcl PH:6.8, 10%SDS, GLYCERIN, H2O),裂解蛋白时加了罗氏的COCKTAIL和氟化钠.电泳先60V，30MIN,后110Vz直到MARKER跑开，转膜用的PVDF膜，100V,60MIN，20%甲醇NO-SDS转膜液。请大侠帮忙分析一下为什么总是做不出来AMPK和P-AMPK。谢谢啦 .附图片，红色比较浅的带是TUBLINE。
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  • NBA (2013-5-18 12:25:20)

    tubulin图呢？

  • 大脑门儿儿 (2013-5-18 12:25:47)


    红色的荧光条带是TUBULIN，分子量54KD, 如果有AMPK应该是绿色的荧光条带，现在是除了TUBULIN弱弱的条带以外，什么都没有，请各位大侠帮忙指导

  • 大脑门儿儿 (2013-5-18 12:26:06)

    今天又试了一次AMPK的条带出来了，但是实在不知道什么原因条带出来了。再看看P-AMPK吧

  • jkobn (2013-5-18 12:26:28)


    相关疾病：
    胃癌
    你好，我想问一下AMPK在正常的组织中是怎么表达的？是不表达？还是低表达？比如他在胃癌组织和胃的正常组织中是否表达？刚刚接触这个，菜鸟一个，希望知道的人能指教。

  • 大脑门儿儿 (2013-5-18 12:26:55)

    正常组织的我也做了，能表达出来，但是我做的BAND不强。关于胃的组织中有没有表达你可以查查文献。我做的脑组织，黄脂肪组织，还有肌肉组织。这三种组织都表达AMPK

  • jkobn (2013-5-18 12:27:21)


    谢谢你啊，那就是在你做的这几种正常组织中都有AMPK的表达，那p-AMPK呢？还有我想问一下你用SDS loading buffer裂解完之后，用什么测蛋白浓度？裂解组织检测AMPK需要超声破碎嘛？如果不做超声有没有影响?

  • 大脑门儿儿 (2013-5-18 12:27:56)


    p-ampk也有表达，我用的BCA试剂盒测蛋白浓度。我现在确实用的超声粉碎，但是我认为不用超声粉碎也没关系，我以前都是用机械粉碎的。

  • jkobn (2013-5-18 12:29:07)


    谢谢你上面的解答。
    SDS loading buffer里面有溴酚蓝，如果用他裂解完，还能用BCA测蛋白浓度嘛？会有影响吗？还有我想问一下，你是在超声粉碎前加的蛋白酶、磷酸酶抑制剂和PMSF，还是超声粉碎完了再加？

  • is2011 (2013-5-18 12:29:31)


    你做的是AMPK -α的吗？

  • 菠萝喵 (2013-5-18 12:30:07)


    你好，我想问下你的罗氏的COCKTAIL和氟化钠的产品编号，最近我也打算做p-AMPK，可是不知道用哪个抑制剂？谢谢楼主了

  • kuohao17 (2013-5-18 12:30:40)

    是不是抗体的问题？CST的AMPK抗体有些怎么做都出不来。
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