【讨论帖】来晒晒自己的转膜条件吧

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-5-18 15:36 作者: mod=8048 来源: 分析测试百科网

最近比较流行”晒“：晒钱，晒车，晒豪宅、晒美女 ^&^ 俺们今天也来晒晒……转膜条件，呵呵！

WB当中转膜效果好的话实验就算是成功了一半。相信大家都有过这样的经验：从制样开始折腾几个小时好不容易转完膜了，看到的却是几乎不可分辨的淡淡的Marker条带，心情的郁闷是不用说了，有时候都不知道继续往下做是不是还有意义，尤其是一抗本来就不是怎么好的时候。遇到这样的情况应该如何改进呢？看到坛子里面问转膜条件的帖子不少了，我在这里抛个砖，大家有玉的砸玉，没玉的砸砖头吧！

我自己平时喜欢用的转膜条件是根据目的蛋白分子量的不同来定的：
分子量 ≤ 30kd：200mA，30min，20%甲醇；
分子量 30kd ~ 50kd：300mA，45min，15%甲醇；
分子量 ≥ 50kd：350mA，60min，10%甲醇；
分子量 ≥ 200kd：同上or 30V，4℃转膜过夜，10%甲醇

有几点经验：
1、如果小分子容易转过的话，可以尝试将转移buffer的浓度减半试试（降低离子浓度），甲醇浓度20%不要变。
2、由于湿转的转移能力“过于强大”，小分子量的蛋白可以尝试半干转，效果比较好。
3、对于某些碱性蛋白可以尝试高pH值的转移buffer（如pH9.0），或者在转移buffer当中加入0.1%-0.5的SDS（听前辈师兄说的，没试过）。高pH的Buffer配方在分子克隆里面有。
4、还是小分子量蛋白，实在不行了就用0.2um孔径的膜吧，贵一点，遇上难做的小分子还是挺管用的。不过0.2的膜通常背景都很高，封闭用milk浓度加大到8%，封闭和洗脱的时间适当加长，并且二抗的浓度要降低一些，我一般是用平时的1/4浓度。
5、大分子量的蛋白按照以上”转膜过夜“条件不会转不动，如果还是没有条带的话应该看看你SDS-PAGE的时候是不是跑的足够下来
6、还有以前说过的一点：转移buffer按照分子克隆的配不用调节pH，加入甲醇后pH应该就是8.3的。调了反而不好，因为人为增加了离子浓度。同理，用的甲醇越纯越好。