【求助】WB条带不均

最新回复

• tuuu2 (2013-5-18 15:48:07)

  
  把做胶的缓冲液重新配一下。做玩新胶后，先考马染色看看，条带正常否。

• qhyu (2013-5-18 15:48:27)

  可能是目的蛋白丰度太低造成的。建议
  1、加大蛋白上样量。
  2、加大1抗和2抗的剂量。
  另外，我有时做一些极限分子量的蛋白时，也会出现那样的情况。因此，可能胶的浓度不合适也会造成上述的情况。

• 扫雷军kuzi (2013-5-18 15:49:11)

  
  但是这些蛋白我以前都做过，同样的条件，结果都是很好的。做胶的缓冲液我也换了，还是这样。

• DONT (2013-5-18 15:49:51)

  
  是不是胶凝的不均匀啊?或者是煮蛋白样的时候，加的loading buffer 太少了，样品没有完全煮开，上样量太大？

• DONT (2013-5-18 15:50:10)

  
  对了，你的marker跑的怎样阿？

• flower-201 (2013-5-18 15:50:44)

  
  感觉是不是胶不均匀，楼上说的也对，你的maker跑的怎么样？？

• 扫雷军kuzi (2013-5-18 15:51:09)

  
  marker 跑得很好。我今天又作了一次，把以前跑得很好的2个旧的样本也拿出来跑，作为对照，结果是所有的样本跑得都不好。现在真的不知道是什么原因，要说胶不好，但是每次marker都跑得很好；如果是上样缓冲液的问题，我把以前跑得很好的旧的样本拿出来跑，也出现同样的问题。

• xue258 (2013-5-18 15:51:39)

  
  是胶的问题，还有可能是SDS的问题，marker跑得好是另一回事的。

• zhezhe (2013-5-18 15:52:00)

  
  样本问题，样本要充分煮沸~~

• 扫雷军kuzi (2013-5-18 15:52:26)

  
  样本是充分煮沸了的。要是胶的问题的话，是什么问题呢？配胶的所有东西我都换了阿，SDS也新配了。

• rxcc33 (2013-5-18 15:52:46)

  
  5L，已经说出了问题的实质（尽管是没留过几次言的新手），上样量过大，蛋白浓度过高。
  由于上样量过大，sample中的盐离子浓度过高，引起的带型波动。当然蛋白浓度过高也是主因。
  解决的方案，首选是降低上样量。
  如果你对自己的WB没信心，那么第二种选择就是仍loading相同体积的样品，但是样品先用H2O稀释一下。
  类似我们loading cell lysis，通常只上2-5ul，但是loading的体积仍然20ul左右，原因就是每个eppendorf管预先加入10ulH2O，再加5ul cell lysis＋5ul LB＝total 20ul
  
  此外，某些地方带丢失是因为赶气泡时，用力不均。
  当然你也许会问，上样过大应该每个条带都很浓，而你明显有些条带信号丢失，所以居然3L建议你加大上样量！！？
  实际上，我们老祖宗的一句话早就解释得很清楚了——过犹不及。
  当局部区域蛋白浓度过高的时候，ECL会被HRP快速消耗，导致淬灭，这个问题我和其他战友已经多次在坛子上提过，所以你的蛋白会斑斑点点，不均一。做实验的时候，可以来点中庸之道，切切！

• nut6694 (2013-5-18 15:53:28)

  QUOTE:

  原帖由 rxcc33 于 2013-5-18 15:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  5L，已经说出了问题的实质（尽管是没留过几次言的新手），上样量过大，蛋白浓度过高。
  由于上样量过大，sample中的盐离子浓度过高，引起的带型波动。当然蛋白浓度过高也是主因。
  解决的方案，首选是降低上样量。
  如果你对自己的WB没 ...

  你好，请教一个问题，一下是我跑得组织的actin，为什么会出现这种形状的呢？

  
  72827771.snap.jpg

• 68943512yao (2013-5-18 15:54:35)

  QUOTE:

  原帖由 nut6694 于 2013-5-18 15:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  你好，请教一个问题，一下是我跑得组织的actin，为什么会出现这种形状的呢？

  蛮正常的；如果不是用的旧抗体，那么整个WB操作需要提高一些。
  简单的弥补策略，用新配的一抗重新标一下；
  如果重新跑胶，上样量提高到1.2倍左右

• nut6694 (2013-5-18 15:55:12)

  QUOTE:

  原帖由 68943512yao 于 2013-5-18 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  蛮正常的；如果不是用的旧抗体，那么整个WB操作需要提高一些。
  简单的弥补策略，用新配的一抗重新标一下；
  如果重新跑胶，上样量提高到1.2倍左右 ...

  整个WB操作？请教，有没有具体的提点呢？
  还有一个问题就是，我用细胞做BCA定量和WB，内参跑得还可以的。但是组织的就是一直做得不好。请问，您有什么经验和建议吗？望回复。非常感谢！

• fsdd817 (2013-5-18 15:55:40)

  
  注意每一步细节，没别的了；因为应该是综合效应下，条带偏弱，所以也可以通过略微加大上样量弥补。
  其实，组织和细胞样品都差不多，只是前者细胞更杂，定不准，包括标准体积定量，所以只能依赖BCA和经验定量；更偏重经验值。