【求助】180KD的VEGFR1/VEGFR2的wb做不出!

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-5-21 12:56 作者: flyxx05 来源: 分析测试百科网

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【求助】180KD的VEGFR1/VEGFR2的wb做不出!

我在做180KD的VEGFR1/VEGFR2的wb,做了快2个月了,从来没有目的条带出来,急死了.
用考马斯亮蓝染色时目的条带也不清楚,请问我需要增加上样量吗?我现在上样的总蛋白量是50微克.谢谢!

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damingxia0904 (2013-5-21 12:56:49)

上总蛋白就能看见目的带了吗？不知道楼主用的是什么细胞，我做EGFR的，170KD，总蛋白里条带这么多，你怎么判断那条是目的带？
gmjghh (2013-5-21 12:57:11)

QUOTE:
原帖由 damingxia0904 于 2013-5-21 12:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
上总蛋白就能看见目的带了吗？不知道楼主用的是什么细胞，我做EGFR的，170KD，总蛋白里条带这么多，你怎么判断那条是目的带？
说说你的实验条件？
flyxx05 (2013-5-21 12:57:32)

我的实验条件是:
1. 8%的分离胶,5%的浓缩胶,上样量是10微升(含50微克蛋白),电泳时60V跑浓缩胶,80V跑分离胶,到溴酚蓝完全跑出停止电泳.
2. 用NC膜,湿转,350mA转2h;
3. 2.5%的脱脂奶粉室温摇床下封闭2h;
4. 一抗过夜,一抗是Lab vision公司兔子抗大鼠的多抗
5. PBST洗三次,每次15分钟
6. 荧光标记的二抗摇床室温1h
7. PBST洗三次,每次15分钟
8. 红外线扫描看结果
flyxx05 (2013-5-21 12:57:52)

相关疾病：
糖尿病
我是提取的组织蛋白,糖尿病大鼠的肾脏皮质
yueban-1147 (2013-5-21 12:58:22)

试一试，减小胶浓度，同时缩短电泳时间看看。
flyxx05 (2013-5-21 12:58:58)

跑电泳时加的有marker,用考马斯亮蓝染胶时在对应于marker的第一条带(250kd)和第二条带(130kd)之间的几乎没有条带,我的目的蛋白是180kd

57690894.jpg
yueban-1147 (2013-5-21 12:59:41)

可能是你蛋白提取的问题吧
你的蛋白是膜蛋白啊
BOSS2011 (2013-5-21 13:00:09)

QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2013-5-21 12:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
可能是你蛋白提取的问题吧
你的蛋白是膜蛋白啊
还是先看看你的目的蛋白本身的性质，如果它是跨膜次数比较多的，或者疏水性比较强的蛋白，可能用普通的提全细胞蛋白的方法无法得到足够的量。另外还要看看这个蛋白本身在细胞中的表达水平，如果这个蛋白本身表达量比较少，WB也有可能做不出来的。
我的目的蛋白也是一个膜蛋白，曾经一度怀疑比较难提取，还尝试了很多提取膜蛋白的方法，后来发现用普通的提取全细胞蛋白的方法就可以足够做WB了。还是事先了解一下你的目的蛋白比较好，不然会走很多弯路。这也是算是我得到的经验教训，呵呵。
nvdabing (2013-5-21 13:00:39)

make sure transfer is successful.
and pay attention to other clear bands that have been already detected ,
maybe isoforms existing based on the fact that it's a receptor protein.
ritou1985 (2013-5-21 13:01:07)

如果是组织的话，建议你提高上样量。我用HUVEC细胞做，一般上样也要50ug的。组织里杂蛋白比较多，最好多用电蛋白。
chenshuanhe (2013-5-21 13:01:32)

VEGFR1是180KD,VEGFR2是200KD吧？
flyxx05 (2013-5-21 13:01:57)

原来的抗体用完了，又买了两只抗体，分别是abcam公司的（VEGFR2）和Genetex公司的（VEGFR1)，仍然没有做出来，现在改做免疫组化了。
qianqin1977 (2013-5-21 13:02:20)

我也在做这个，买了提取膜蛋白的试剂盒，试试吧！
u234 (2013-5-21 13:03:01)

我做VEGFR2一个多月了，也从来没见到目的蛋白。闹心啊！！！我做的是肝癌组织
1、分离胶用过8%、7.5%、6%的，浓缩胶都是5%
2、上样量15~20 ul(蛋白浓度大约11 ug/ul)
3、电泳：恒压120v,等到Marker的250KDa~130KDa分开的距离为1.2厘米左右停止
4、转膜：350mA,3小时
5、1%BSA封闭1小时
6、TBST洗涤10分钟，3次
7、一抗冰上孵育过夜（Santa Cruz,小鼠抗人单抗，1：300，冰上，慢摇）
8、TBST洗涤10分钟，3次
9、二抗室温慢摇孵育2小时，1：5000，Santa Cruz，兔抗鼠，HRP标记
10、TBST洗涤10分钟，3次
11、ECL化学发光
12、显影、定影
13、结果：
（1）X胶片上未见任何蛋白条带（一直都是）。（图片等待上传）
（2）丽春红染膜隐约看见蛋白条带，但不多。（图片等待上传）
（3）考马斯亮蓝染胶2小时，脱色2小时，可见250KDa~130KDa之间有蛋白条带，其中有一条比较浓，其它都很细很浅。（见图）

85607624.snap.jpg
u234 (2013-5-21 13:03:33)

1、提取肝癌组织总蛋白用的是碧云天的RIPA裂解液（强）
2、每20mg组织加150ul的裂解液（含PMSF）
3、匀浆，20000转左右
4、充分裂解30分钟后，超声1分钟
5、低温高速离心10分钟（4°c,12000转），取上清
6、按比例加5xSDS上样缓冲液，100°c煮沸10分钟

请高手们指点，目的蛋白都没出来过，心烦呀，一睡觉就做噩梦呀！！！
谢谢啦！！
u234 (2013-5-21 13:04:17)

今天把其它图片传上。

45488768.snap.jpg
u234 (2013-5-21 13:04:41)

继续上传：

11985010.snap.jpg
u234 (2013-5-21 13:05:12)

继续上传：

20461594.snap.jpg
u234 (2013-5-21 13:05:39)

继续继续，

43950783.snap.jpg
ha111 (2013-5-21 13:06:21)

楼上：

我做过一次没有目的条带的，当时是忽略了一抗种属来源必须和二抗相匹配

我当时一抗是小鼠来源的，二抗却用了羊抗兔的

你看看你的一抗和二抗匹配吗