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培养的贴壁动物细胞的蛋白质抽提步骤【分享帖】贴壁细胞、悬浮细胞及组织蛋白质的抽提步骤
1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。
2、预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 µl蛋白酶抑制剂混合液，5 µl PMSF和5 µl磷酸酶混合液）。
4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。
5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14,000xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤
1、2500xg离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液
2、预冷的PBS悬浮沉淀细胞，2500xg离心10分钟沉淀细胞，去上清。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 µl蛋白酶抑制剂混合液，5 µl PMSF和5 µl磷酸酶混合液）。
4、加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂）
5、轻轻摇动混和15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14,000xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤
1、组织称重，切小块放入管中。
2、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 µl蛋白酶抑制剂混合液，5 µl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。
3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。
4、用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。
5、裂解液于预冷的离心机中14,000xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
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最新回复
taoshengyijiu (2013-5-21 13:34:24)
蛋白质抽提试剂的成分?
12xunmei (2013-5-21 13:34:54)
QUOTE:
楼主是做药理实验的么 你这样提出来的蛋白 提取率以及稳定性如何？呵呵～wawa (2013-5-21 13:35:29)
很好。我是用BioTek的全波长的酶标仪测得。我不是做药理的，但是培养的细胞肯能是要加刺激的，这也可以称为广泛的药理吧
@STAR@ (2013-5-21 13:36:43)
我想要 用TRIZOL提RNA蛋白的步骤
wawa (2013-5-21 13:37:03)
不好意思，没明白你的意思？RNA是RNA，蛋白是蛋白，怎么会有RNA蛋白呢？
你是说要提取转录因子？
脱水萝卜 (2013-5-21 13:37:36)
TRIZOL也可以的，但是效率很低。
yes4 (2013-5-21 13:37:54)
ffooll (2013-5-21 13:38:17)
我也想要用trizol 同时提取RNA和蛋白质，有哪位大师这样做过呢？
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