免疫电镜技术

免疫电镜(Immune electron microscopy)简介

（一） 原理   免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。
（二）影响免疫电镜的一些因素
1．标记物   用于电镜观察的标记物有三类：一类是电子密度致密的标记物，如铁蛋白、辣根过氧化物酶等。另一类则是放射性同位素，如135I、35S、32P、14C、3H等，第三类则是有独特形状的标记物，如血兰蛋白、噬菌体等。
对标记物的要求是：具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状。目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和HRP。两者各有其优点，铁蛋白电子密度致密。观察时反差大，优于酶标记，但铁蛋白分子量大(460 000)，穿透能力差，所以适于细胞表面抗原的定位，另外铁蛋白的标记过程比较复杂。HRP分子量小(40 000)，穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。
2．固定剂   固定是免疫电镜较关键的一步，免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构,又要考虑到抗原的失活性问题。
（1）固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。
（2）影响固定的因素有：①采用固定剂的种类；②固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；③固定剂的pH；④固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞的自浴作用和水分的抽提；⑤固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致；⑥与被固定的细胞类型有关。
目前常用的固定系统有：4%聚甲醛，1.5%～2%戊二醛，1%多聚甲醛＋1%戊二醛，4%多聚甲醛＋0.5%苦味酸＋0.25%戊二醛，96%乙醇＋1%醋酸。不论采用哪些系统，使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条件。
3．非特异性吸附   非特异性吸附与酶标抗体、抗血清的稀释度、染色时间，温度及介质等有关，其中最主要的是抗血清及标记抗体的稀释。一般认为高效价抗血清或标记抗体稀释到低蛋白浓度，用于标记染色可获得最理想的结果。因为低蛋白浓度有利于降低非特异性吸附。实际应用的蛋白浓度大致在0.50mg/ml～2mg/ml。工作效价一般在1︰20～1︰400,在实际工作中，将标记抗体或抗血清稀释到1︰100倍以上则可获得理想的阳性结果，而非特异性吸附必然降得很低。
工作浓度的选择是将标记抗体或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀释，做已知阳性标本的标记染色观察，取其阳性沉积物明显，而非特异性吸附最低的一稀释度做为工作浓度。
4．标记染色法 标记染色法分为直接染色法与间接染色法两种。前者的特点是特异性较高,敏感性低，标记抗体只能用于检测一种抗原。后者敏感性较强，一种标记抗体可用于多种抗原的检测。缺点是特异性较差。

铁蛋白免疫电镜技术
（一）        原理
免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。
（二）材料与试剂
1．马脾铁蛋白
2．硫酸铵
3．硫酸镉
4．双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。
5．0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液
6．0.1Mol/L硫酸铵液
7．0.05Mol/L pH 7.4 PBS液
（三）操作方法
1．铁蛋白的提取
⑴ 配制2%硫酸铵液，并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。
⑵ 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4℃过夜。
⑶ 1 500g离心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸铵至100ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。
⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。
⑸ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。
⑹ 以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。
⑺ 重复步骤⑹一次。
⑻ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。
⑼ 100 000r/min离心2h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。
⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤，使铁蛋白含量为65mg/ml～75mg/ml，分装，4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。
2．铁蛋白－抗体交联法
⑴ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml～25mg/ml。
⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min，离心去沉淀。
⑶ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白－XC液，4℃搅拌48h。
⑷ 以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢复到生理水平。
⑸ 超速离心 以1.00×105g离心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮， 再次离心，以除去未结合的IgG。
⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。
3．铁蛋白－抗体结合物处理标本
（1）将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。
（2）用冷的PBS液洗涤，离心。
（3）如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20min，不时振荡,
（4）以冷PBS液洗涤三次，离心。
（5）沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗涤。
（6）再以锇酸固定，脱水包埋。
也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下：
⑴ 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。
⑵ PBS液洗涤离心。
⑶ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3h。
⑷ 取出，切成小块，以PBS液洗涤。
⑸ 置干燥器中以硅胶干燥。
⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。
⑺ 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。
⑻ 5min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。
⑼ 凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。
⑽ 水洗、晾干、电镜观察。
（四）结果判定
在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)。

酶免疫电镜操作步骤
1．酶标抗体的制备
2．取材   将培养细胞或悬浮细胞用0.1Mol/L PBS液冲洗，离心沉淀后，立即转入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2，4℃固定5min～30min(依抗原性质所定)。如病料为组织块，则取适当大小，先固定1h然后取出，以新的双面刀片切成50～100µm的薄组织再行固定1h～2h。
3．漂洗   以PBS液漂洗过夜，换液3～4次。
4．血清孵育，25℃1h或4℃过夜，孵育的标本放置于加盖的瓷盘内，底层垫数层纱布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脱，造成非特异性吸附。
5．PBS冲洗3～4次，每次10min。
6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。
7．PBS液冲洗3～4次每次10min。
8． 酶标记抗体孵育；用适当稀释的酶标抗体(即工作浓度)于25℃湿盆内孵育1h或4℃过夜。
9． PBS液冲洗3～4次每次10min或4℃漂洗过夜。
10．酶显色处理 将漂洗后的标本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。显色强弱与戊二醛的固定有关。若显色弱则可减少甚至取消戊二醛的固定时间。冲洗时必须注意防止非特异漂浮的沉积。
11．常规包埋、切片、电镜观察 在经过脱水包埋确定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色，切片一般在2µm～4µm，切片后染色不存在通透困难的问题。无论在标记染色后切片还是在切片后标记染色，最好在光镜下定位选择后，再做电镜定位包埋，这样目的性强，可减少工作量。