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【求助】IgG的纯化(硫酸胺)，做了Ｎ次啊．帮帮忙！
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文献中步骤如下:
１．取一份血清加入4份醋酸缓冲液, 以每毫升稀释液加入25ul正辛酸的比例, 加入正辛酸, 搅拌30min.4°C 5000r/min 离心30min,弃沉淀.
２．以1ml体积上清液加入0.227g硫酸铵的比例, 缓慢加入硫酸铵粉末, 室温条件下继续搅拌30min之后,5000r/m in 离心15min.沉淀溶于1/10体积 的PBS缓冲液中, 透析至无NH4, 冰冻干燥, 称重,计算抗体回收率,并进行纯度鉴定。
我做了几次都是这样，
在步骤１（加正辛酸）中离心后能看见白色沉淀，但表面有一薄层奶烙状白膜（会是什么？），正常吗？我把白色沉淀和白膜都弃去．
在步骤２（加硫酸铵）中离心后看不见沉淀，但表面又出现奶烙状物质（大概３－４毫米厚）．怎么回事啊？IgG在哪啊．
请问，你们做时会出现白膜吗？加硫酸铵能看见沉淀吗？
做实验做的很郁闷．高手帮帮忙，先谢过了！
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最新回复
mickeylin (2013-5-25 12:42:26)
用电泳检测各组分就知道是什么了,抗体纯化的方法很多,要想得到纯点的收率好过柱子是不错的方法.
王小主 (2013-5-25 12:43:19)
表面奶烙状物质很软,很容易碎
另外,我用的硫酸铵是颗粒状,刚看见有的贴上写要用粉末.是不是一定要碾碎?
寻梅 (2013-5-25 12:45:28)
1.正辛酸是脂肪酸,4度离心会在表面有一薄层奶烙状白膜,可以通过过滤除去.
2.加硫酸铵要在4度边搅拌边缓慢加,加完最好静置2h,离心5000Xg离心15min，收集沉淀物;溶于PBS中透析除去硫酸铵;
祝你成功
王小主 (2013-5-25 12:45:54)
谢谢!
我是从正常人血浆提取IgG
加硫酸铵后表面奶烙状物质很多,是不是蛋白变性啊.肉眼看不见底部有沉淀.
正常的话,沉淀多不多?
步骤１（加正辛酸）我调PH为4.5
步骤２（加硫酸铵）是否要调PH?
079777chao (2013-5-25 12:50:08)
我想你的问题出在这里：
在加硫酸铵之前一定要调pH值（调到7.4），我没有直接加硫酸铵粉末，而是把硫酸铵首先配成饱和的，再加入，终浓度大约40%
王小主 (2013-5-25 12:50:40)
QUOTE:
谢谢,我再试试!不过我可能还是要加硫酸铵粉末.因为加硫酸铵饱和液后整个液体体积增大,而我们的冷冻离心机能离心的液体有限.
zsxan1990 (2013-5-25 12:51:00)
你在血清里直接加饱和硫酸氨至40％或50％就行了啊，加前要将硫酸氨调节pH至7左右，不然酸度太高会使蛋白变性。1，2个小时后离心，溶解，透析过夜
不要照文献搞得好麻烦
我这样做纯化了百来个IgG了，绝对没有问题
或者你还可以过亲和柱
wanglaoshi (2013-5-25 12:51:42)
不要照文献搞得好麻烦
我这样做纯化了百来个IgG了，绝对没有问题
或者你还可以过亲和柱
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该方法需要先用低浓度硫酸氨去处杂蛋白吗?
仅用硫酸氨纯度如何? 我这没法进行层析啊.
得率呢?一般20ML血清能提到多少IgG?
还有, 加硫酸氨后的沉淀好不好溶解啊?
wanglaoshi (2013-5-25 12:52:23)
不过结果还是不怎么好,得率很低.还得摸条件.
vcve (2013-5-25 12:53:22)
不过结果还是不怎么好,得率很低.还得摸条件.
你是先调血清的pH至7.4？
沉淀好融解吗？
你这样再加硫酸氨粉末还是会使pH狂降的啊
如果不好溶说明还是太酸蛋白变性了
王小主 (2013-5-25 12:54:55)
沉淀搅拌后能融解,但透析时又出现少量絮状物,难道变性?
你说太酸蛋白变性，那我在步骤１（加正辛酸前）调PH为4.5，会容易变性吗？
你说的方法需要先用低浓度硫酸氨去处杂蛋白吗?效果如何？谢谢！
bohe221 (2013-5-25 12:55:21)
抗体在你所做的液体中啊
bohe221 (2013-5-25 12:56:26)
我做卵黄抗体，加正辛酸量大了会有沉淀，我检测过，沉淀里面有抗体成份，据资料所查也可知，正辛酸是可以使抗体析出的，所以你所说的第一步离
心后有沉淀是有部分抗体在里面了
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