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【求助】western blot 检测活化的caspase-3
各位前辈：我用cell signalling的9661检测活化的caspase-3，一抗都用到1：50了，可是结果还是白板，急死了，是不是抗体有问题，我们实验室其他人也都没有结果，都说CT的抗体好呀，我怎么做不出来。同样分子量的其他蛋白都有条带。请高手指点。谢谢~【求助】western blot 检测活化的caspase-3
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最新回复
TAT (2013-5-25 16:07:29)
我前几天也有了这种抗体，结果挺好的啊。它本身是检测两条带35kd和17kd。
pengke1983 (2013-5-25 16:10:20)
TAT (2013-5-25 16:10:57)
kuohao17 (2013-5-25 16:12:52)
因为不知道楼主的操作细节，也不知道一抗二抗的动物来源情况，所以无法判断原因。
CST的技术支持还是不错的。你可以直接发email问他们的技术支持。但一定要把你的操作和问题写清楚，不然谁都无法知道到底哪里出问题了。
orangecake (2013-5-25 16:14:19)
pengke1983 (2013-5-25 16:14:41)
谢谢各位。前辈压片时间长吗？我挺着急的。
TAT (2013-5-25 16:15:02)
我用的一抗1000倍稀释，二抗2000，压了15分钟。
plaa (2013-5-25 16:15:28)
我用的是santa cruz 的抗体，有35/20 Kd两条带，活化的caspase－3是20kd。一抗浓度是1：200，二抗浓度用的是1：1000（这个浓度比平时别的抗体浓度要高，一般我是用1：2000的），压片时间最长有30min的。我觉得cell signalling 的抗体是比较好的，至少我做过的抗体都不错。你说“同样分子量的其他蛋白都有条带”，这说明你的前面的步骤是没有问题的，我觉得可能是你的蛋白里面caspase－3的丰度比较的低，如果你的一抗的来源和二抗的匹配都没有问题的话，的你可以适当的把一抗孵育的时间，二抗的浓度，以及ECL曝光的时间延长一些，我做过的有的蛋白一抗孵育过夜还要ecl过夜才能出来条带呢。如果能有条带，哪怕不怎么好，你也可以再改条件。祝你好运！
00无名指00 (2013-5-25 16:15:49)
请问楼上用的santacruz的哪个型号？
zhezhe (2013-5-25 16:16:17)
911 (2013-5-25 16:16:40)
vivian4123 (2013-5-25 16:17:41)
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你好，我是用的抗体是CST（9664）的cleaved caspase-3（17/19kD），没做出来。这个抗体不检测未活化caspase-3（35kD）
组织：新生6天SD大鼠脑海马组织的，提取的是全蛋白，储存-80的；
上样量：为60微克/lane；10%的胶（细胞色素C14kD跑出来了，但cleaved caspase-3没出来）
电泳参数：浓缩胶60v、30min，分离胶120v、60min；
转膜（半干转）：恒流转，按照1mA/cm2（我同时跑的两块胶，胶总面积为16.6cm2，所以我转膜的电流为16mA），时间按照分子量定（1min/kD），选择了19min
封闭：5%脱脂牛奶封闭1小时
一抗：5%脱脂牛奶稀释（1:1000），摇床上摇1h，4度过夜
二抗：5%脱脂牛奶稀释（1:2000），摇床上摇1h
洗膜：PBST洗10min*3遍
显色：ECL显色
注：1.同样的胶和转膜方法， 同时做的细胞色素C（14kD）就做出来了，不过信号也不是很强。
2.β-actin也全部做出来的，不知道为什么就是cleaved caspase-3出不来，
实验老是做不出来，也怕被怕被老板说，着急啊~~~~
你可以吧你的步骤给我说说吗？非常感谢~~~~
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