【求助】蛋白聚集在阴离子交换柱上面

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-5-25 17:22 作者: standbyme 来源: 分析测试百科网

我的蛋白是包涵体，溶解在8M尿素中，用8M尿素和pH8.5Tris-HCl作为平衡液和上样Load，然后在平衡液中加入NaCl洗脱，但是在NaCl浓度达到1.5M时仍有大量蛋白未被洗脱。曾优化过平衡液的pH，发现pH在6.0到10之间蛋白均能吸附在柱子上，且经1.5MNaCl洗脱后均有大量蛋白洗不下来。我的蛋白的等电点在8左右。后来在平衡液中加入TritonX-100或者巯基乙醇等，结果并没有改善，很困惑。想求助前辈，帮助我分析一下原因。

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【求助】蛋白聚集在阴离子交换柱上面

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最新回复

standbyme (2013-5-25 17:23:13)

我用的是DEAE-Cellulose层析柱
owanaka (2013-5-25 17:23:40)

没见过这么做的，去掉尿素复性后在挂柱子吧。
你的蛋白pI是8.0，能在pH6.0挂阴离子柱，就不正常。
standbyme (2013-5-25 17:24:10)

QUOTE:
原帖由 owanaka 于 2013-5-25 17:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
没见过这么做的，去掉尿素复性后在挂柱子吧。
你的蛋白pI是8.0，能在pH6.0挂阴离子柱，就不正常。
之前经透析后损失了部分蛋白，所以想先在变性的条件下柱纯化后再透析。且实验室正好有这个填料，所以就先选这个用了。最初也用pH9.0和9.5做过小试，但是结果没有太大差别。
bring (2013-5-25 17:24:33)

最笨的方法就是6M盐酸胍，什么都洗下来了
standbyme (2013-5-25 17:25:07)

我可以试试盐酸胍，不过我希望前辈们能帮我分析一下可能是什么原因造成这样的结果的。
cj_mondy (2013-5-25 17:26:26)

柱上复性以前苏老师的实验室研究过（有论文，应该好找），尿素上样后，8M 尿素再平衡，先尿素梯度 8-0M（或1-2），再盐梯度。你现在的蛋白全沉在柱子上了。 NaoH 或盐酸胍洗吧
jkobn (2013-5-25 17:26:46)

我可以试试盐酸胍，不过我希望前辈们能帮我分析一下可能是什么原因造成这样的结果的。

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简单的说就是8M尿素没有能让蛋白彻底变性，部分蛋白在柱上沉淀了
hustwb (2013-5-25 17:27:25)

这种情况下你的蛋白不是没有洗脱下来，而是大部分沉淀在上面了。
当你的蛋白在变性下在DEAE上富集时，量过多就会沉淀下来。
在盐酸胍条件下纯化也行，有点小问题就是溶液比较粘稠，柱压高。
不知道你的蛋白是不是带标签？
jkobn (2013-5-25 17:27:51)

QUOTE:
原帖由 hustwb 于 2013-5-25 17:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
这种情况下你的蛋白不是没有洗脱下来，而是大部分沉淀在上面了。
当你的蛋白在变性下在DEAE上富集时，量过多就会沉淀下来。
在盐酸胍条件下纯化也行，有点小问题就是溶液比较粘稠，柱压高。
不知道你的蛋白是不是带标签？ ...
盐酸胍电导率太高了,没办法用离子交换. 建议加标签镍柱纯化
yonger (2013-5-25 17:29:19)

这不象是挂柱，是在柱子上发生沉淀吧？试验设计本身就违反离子交换层析原则, 你的蛋白PI= pH8, 用阴离子交换层析, pH应该>pH10。

建议你先用G25脱盐， G25用 pH10以上，总盐浓度底于0.1M的binding buffer来平衡。脱盐后离心去掉沉淀再上样。或你改用阳离子交换填料（ sucha sas S-Sepharose, 醋酸纤维填料也行)， pH6 binding buffer平衡。
fox_79 (2013-5-25 17:33:15)

搞懂基本的背景知识，再做实验。
足量的8M尿和6M胍，可以使绝大多数蛋白完全变性。没有变性完全的，也即没有溶解的，你溶解完了要离心才能进入下一步实验吧。
任何复性方式，都不可能100%，也就是说复性过程中必然会有沉淀析出，不管是柱子上原位复性还是稀释或者透析。
任何复性过程，变性剂的除去都是个渐变的过程，逐渐降低变性剂的浓度。
用于变性的盐酸胍溶液是多高的盐浓度啊！怎么能够挂离子柱？乱出主意。
在G25分子筛脱盐？不把你柱子堵死才怪。
你蛋白pI是8.0，能在pH6.0上阴离子柱，那是堆在上面的不是挂在上面的吧

复性过程中损失时必然的。复性完了，离心后再纯化吧。也可以在G25上，一直在8M脲的情况下，部分纯化后再复性。