【求助】提取海马神经组织做的bcl-2的western...

最新回复

• INK (2013-5-25 17:38:54)

  你用的是哪个公司的抗体呀？我们实验室用CST的Bcl-2就没有出现两条带。有这么几种原因：1、抗体的杂带。虽然是单抗，但不一定会像说明书上说的那么好。2、蛋白降解。会出现比蛋白本身分子量小的杂带。但此种情况一般杂带多，也不会出现你图片中清晰的一条杂带。 其实你只要对准分子量，上面的条带是你的目的条带，那么裁剪图片时只留上面一条就可以了，杂带是常有的事情。

• youreyes (2013-5-25 17:39:26)

  QUOTE:

  原帖由 INK 于 2013-5-25 17:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  你用的是哪个公司的抗体呀？我们实验室用CST的Bcl-2就没有出现两条带。有这么几种原因：1、抗体的杂带。虽然是单抗，但不一定会像说明书上说的那么好。2、蛋白降解。会出现比蛋白本身分子量小的杂带。但此种情况一般杂带多 ...

  你好，谢谢你的回复~~
  用的就是CST的单抗厄，应该质量还不错的~~~
  如果蛋白降解，会是什么原因呢？样本保存不好吗？

• sunshine039 (2013-5-25 17:40:05)

  
  求楼主实验条件，我也用cst的抗体， 怎么显都显不出影来。

• 9900 (2013-5-25 17:40:26)

  有时候strip不完全，其他地方也会出条带哦~必须的了~呵呵
  另外有时候有些蛋白跑出来就是好几条条带，比如BDNF，因为有一个pro-BDNF，没办法~

• BOSS2011 (2013-5-25 17:41:20)

  求楼主实验条件，我也用cst的抗体， 怎么显都显不出影来。
  
  ======================
  
  上样量多少?抗体稀释比例?

• BOSS2011 (2013-5-25 17:42:13)

  你好，谢谢你的回复~~
  用的就是CST的单抗厄，应该质量还不错的~~~
  如果蛋白降解，会是什么原因呢？样本保存不好吗？
  
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  cst的抗体是很好的,但公司所说的没有杂带是细胞样品，组织样品并不一定,有时会有非特异结合.
  应该不是降解带，降解带不会比主带强这么多。
  google了一下，paper里面海马组织bcl-2也没有show两条带的情况.
  ７０％可能是实验中某个环节的问题，比如抗体的交叉污染，样品的交叉污染等。如果确实不是，可能是bcl-２的cleavage，但这种可能性并不大..

• youreyes (2013-5-25 17:42:57)

  cst的抗体是很好的,但公司所说的没有杂带是细胞样品，组织样品并不一定,有时会有非特异结合.
  应该不是降解带，降解带不会比主带强这么多。
  google了一下，paper里面海马组织bcl-2也没有show两条带的情况.
  ７０％可能是实验中某个环节的问题，比如抗体的交叉污染，样品的交叉污染等。如果确实不是，可能是bcl-２的cleavage，但这种可能性并不大..
  谢谢~~~
  
  ======================================================================
  
  bcl-2我都是现配的抗体，才买来的，应该不会有污染吧？
  你觉得什么的可能性最大啊？
  我同时还做了bax，bcl-xl等等，都没这种情况；老板也问我怎么会这样，我也不知道怎么说~~~
  这种图片把下面的条带截掉，可以上图吗？准备发sci。
  谢谢了~~

• BOSS2011 (2013-5-25 17:43:32)

  bcl-2我都是现配的抗体，才买来的，应该不会有污染吧？
  你觉得什么的可能性最大啊？
  我同时还做了bax，bcl-xl等等，都没这种情况；老板也问我怎么会这样，我也不知道怎么说~~~
  这种图片把下面的条带截掉，可以上图吗？准备发sci。
  
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  谢谢了~~
  是第一次上还是stripe之后的？bcl-xl是两条带吧？重复之后也是这样吗？
  应该可以裁掉，但如果真是cleavage，您就亏了。

• youreyes (2013-5-25 17:44:00)

  QUOTE:

  原帖由 BOSS2011 于 2013-5-25 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  bcl-2我都是现配的抗体，才买来的，应该不会有污染吧？
  你觉得什么的可能性最大啊？
  我同时还做了bax，bcl-xl等等，都没这种情况；老板也问我怎么会这样，我也不知道怎么说~~~
  这种图片把下面的条带截掉，可以上图吗？准备发sci。
  
  ===== ...

  谢谢回复~~~
  恩，bcl-xl是两条带。
  bcl-2两次都是这样，不过有一次感觉下面的条带要浅一点。
  “是第一次上还是stripe之后的？”是什么意思啊？如果真是cleavage，为什么亏了啊？您意思是数据不上可惜了？

• BOSS2011 (2013-5-25 17:44:25)

  QUOTE:

  原帖由 youreyes 于 2013-5-25 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  谢谢回复~~~
  恩，bcl-xl是两条带。
  bcl-2两次都是这样，不过有一次感觉下面的条带要浅一点。
  “是第一次上还是stripe之后的？”是什么意思啊？如果真是cleavage，为什么亏了啊？您意思是数据不上可惜了？ ...

  像甲醛版主所说，会不会是没有stripe干净的其他条带，是新膜第一次上抗体，还是stripe之后的膜？
  
  两次都这样，两次是同一个样品，还是不同的样品？
  
  如果是bcl-2的剪切，那您可能丢掉了更重要的数据，但这种可能性确实很小，我也做bcl-2，也用cst的抗体，从来没有做出过剪切，更不要说这么清晰的剪切带了。不过样品来源不一样，也不能说绝对不是。

• youreyes (2013-5-25 17:44:56)

  求楼主实验条件，我也用cst的抗体， 怎么显都显不出影来。
  
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  组织：新生6天SD大鼠脑海马组织的，提取的是全蛋白，储存-80的；
  上样量：为30微克/lane；10%的胶
  电泳参数：浓缩胶60v、30min，分离胶120v、60min；
  转膜（半干转）：恒流转，按照1mA/cm2胶总面积；时间按照分子量定（1min/kD），即26min
  封闭：5%脱脂牛奶封闭1小时
  一抗：5%脱脂牛奶稀释（1:1000），摇床上摇1h，4度过夜
  二抗：5%脱脂牛奶稀释（1:2000），摇床上摇1h
  洗膜：PBST洗10min*3遍
  显色：ECL显色

• youreyes (2013-5-25 17:46:19)

  像甲醛版主所说，会不会是没有stripe干净的其他条带，是新膜第一次上抗体，还是stripe之后的膜？
  
  两次都这样，两次是同一个样品，还是不同的样品？
  
  如果是bcl-2的剪切，那您可能丢掉了更重要的数据，但这种可能性确实很小，我也做bcl-2，也用cst的抗体，从来没有做出过剪切，更不要说这么清晰的剪切带了。不过样品来源不一样，也不能说绝对不是。
  
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  谢谢楼主，原因找到了，这是显了bax、洗过之后在显的Bcl-2；就是stripe没洗干净，下面一条大概是21kD~~~
  谢谢~~