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【求助】蛋白质相互作用问题！
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比如有已知蛋白A，要研究蛋白A到底与某细胞系总蛋白中哪一种蛋白相互作用。
出现有两种情况:
1. 利用已知蛋白A作为“探针”,Western blot 检测某细胞系总蛋白的结合分子，发现有条带。
2. 而 蛋白A-亲和柱层析分离某细胞系总蛋白，未能成功获得结合蛋白分子。
问题：Western blot出现条带的位置所对应的凝胶位置应该包含多个蛋白（含结合分子的混合蛋白），有什么办法可以获得纯的蛋白A的结合分子？
（如果能获得单一蛋白条带，通过质谱分析有可能能找到相结合的蛋白分子，问题是怎么样才能获得纯的蛋白条带？）
PS:对这方面不是很了解，请高手帮忙解答一下。先谢了。
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最新回复
ero11 (2013-5-28 13:36:25)
2. 用抗蛋白A的抗体和细胞总蛋白样本做免疫共沉淀
3. 纯化蛋白A后和可能的相互作用对象混合后凝胶过滤层析，看看迁移率是否有变化
4. 酵母双杂交
tuuu2 (2013-5-28 13:36:48)
最快捷的方法是先用蛋白微列阵扫描（protein micro-array)，筛选出可能产生互作的蛋白， 然后按楼上说的慢慢确认。
mysmdbl (2013-5-28 13:37:12)
QUOTE:
实验室做过的亲和层析类似于pull down,应该灵敏度方面不如western blot?
ero11 (2013-5-28 13:37:53)
应该灵敏度方面不如western blot?
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是什么类型的亲和层析？IMAC的话结果基本不能看
按你说的需要，免疫共沉淀之后质谱分析就行了。根据结果再设计下一步的试验。
mysmdbl (2013-5-28 13:38:27)
QUOTE:
实验室做的是HiTrap streptavidin HP亲和层析柱，最后洗脱时没有洗脱峰。但Western blot却看到条带。
不知道免疫共沉淀的灵敏度如何。
蛋白A主要与某细胞系的细胞膜上蛋白相互作用，所以想提取膜上蛋白来做Western blot 或其他方法可能会好些？
flower-201 (2013-5-28 13:38:55)
双向电泳后做质谱分析
xiaoxiaoniao (2013-5-28 13:39:36)
出现有两种情况:
1. 利用已知蛋白A作为“探针”,Western blot 检测某细胞系总蛋白的结合分子，发现有条带。
2. 而 蛋白A-亲和柱层析分离某细胞系总蛋白，未能成功获得结合蛋白分子。
问题：Western blot出现条带的位置所对应的凝胶位置应该包含多个蛋白（含结合分子的混合蛋白），有什么办法可以获得纯的蛋白A的结合分子？
（如果能获得单一蛋白条带，通过质谱分析有可能能找到相结合的蛋白分子，问题是怎么样才能获得纯的蛋白条带？）
PS:对这方面不是很了解，请高手帮忙解答一下。先谢了。
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就像LS说的，2D可解决分离问题。
但是我非常不理解你说的“1.利用已知蛋白A作为“探针”,Western blot 检测某细胞系总蛋白的结合分子，发现有条带。"这句话。不知道我有没有理解错，你是用蛋白A当抗体去孵育膜，然后再用抗蛋白A的抗体检测？或者是蛋白A偶联检测基团。然而Western中膜上为变性蛋白（即便你跑了Native胶，转膜也难保不变性），用蛋白A直接拿去孵育这种行为没有生物学活性意义。而前面几楼提到的Co-IP或者融合蛋白PullDown才是正解。
mysmdbl (2013-5-28 13:40:04)
QUOTE:
2D分离也不失为一种方法，反正做实验就是多试试。不过2D一般用于两种蛋白组学的比较，2D一般实验室做不了，去中心实验室跑个胶后还要借助Western blot才行，
所以想尽量在实验室做，将提取蛋白的范围缩小到细胞膜也相当于将蛋白质种类减少，也等于变相提高蛋白分离的分辨率。
转膜后蛋白变性倒不怕，只要具备某段线性肽段就可以识别了。
非常谢谢您！
kuaizige (2013-5-28 13:40:24)
pulldown后做质谱
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