【求助】明胶酶谱法测MMP，为什么细胞上清液......

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• nn255 (2013-5-31 11:47:53)

  
  加入loading buffer后我的protocol是常温十分钟,不用37度40分钟啊!而且做酶谱法时,一般来说血清都是要稀释的.

• dragonkilly (2013-5-31 11:48:18)

  是啊，后来我用不同浓度的血清跑了一次，结果只是在MMP的部位有比背景更深的条带，而没有那种负染带阿，请问一下，这种情况的原因？下面是我跑的带，照得不是很清楚。

  
  40585233.jpg

• one (2013-5-31 11:48:37)

  
  请问大家做酶谱时，细胞上清是如何定量的啊？是测蛋白的浓度吗？
  细胞上清在用上样缓冲液处理之前，要不要浓缩处理啊?
  如果用细胞上清做WESTERN时，细胞上清如何浓缩处理？
  谢谢了！

• kulee (2013-5-31 11:48:57)

  
  前阵子刚做过细胞上清液的MMP2，用酶谱法，以下是我的一些想法：
  1、血清里是否含有MMP，你的细胞是什么细胞，细胞上清夜一般是细胞外分泌的MMP，血清没做过，但血清成分比较复杂，是否含有抑制MMP表达的一些成分或者和胶中的明胶结合的成分
  2、我们实验室的细胞上清浓缩是用真空抽滤器，但一般我们都不浓缩，直接吸出细胞培养板的上清液做
  3、这是实验室的方法：取1μl各组样本培养液，加入1μl上样缓冲液，按固定顺序加样于含0.1％明胶(Gelatin)的SDS－PAGE凝胶孔中，80V电压电泳，待蛋白进入分离胶后，改为200V继续电泳至溴酚兰到达分离胶底部。取下凝胶，置于100ml 2% Triton X-100中，室温轻摇两次，每次30min，换为显色缓冲液（40 mM Tris HCl, pH 8.0, 10 mM CaCl2, 0.02% NaN3），37 °C孵育16h，考马斯亮蓝染色，脱色，拍照分析

• ffooll (2013-5-31 11:49:18)

  
  细胞上清最好不要浓缩，因为细胞上清中含有各种酶类，而且能够降解明胶的不在少数，如果浓缩了，就有可能出现很多透明带，这样很容易使你无从分析，如果你走细胞上清，肯定是因为上清中你所要的酶含量多，这样不浓缩也能出现透明条带，如果不能做出来，就一定是你的细胞的问题了，要么不表达，要么就是养得不好。
  再说说上面的酶谱，你的酶谱好象蛋白含量很大阿，我一般做时就不脱色，因为脱色前如果有透明条带肯定能在染色时看到，你做得好象不是酶谱了，而是SDS-PAGE了。

• standbyme (2013-5-31 11:49:37)

  
  细胞能做出来是因为你养的多数是肿瘤细胞，而在这些细胞中多数都过表达MMP，而且是激活的。
  血清应避免加热灭活的，分装成小份，贮存在-20，现用现取，避免反复冻溶。
  要是自己制备的血清，而且最好用过表达病人的血清，可以上网查一下，如Serum Matrix Metalloproteinase-2 as a Prognostic Marker in Advanced Cutaneous Melanoma ；Serum markers of matrix turnover as predictors for the evolution of colorectal cancer metastasis under chemotherapy
  正常人血清中MMP多是未激活的MMP-9，这时做酶谱时，SDS的作用就很大了，它可以移除前肽的CYS残基，所以SB孵育时间应该长一些37度30min（用细胞可以不孵育的，我做出来过），或者温度高一些50度5min。
  建议你如果用血清的话，1。选择合适的血清来源
  2。做酶谱时，加一个阳性对照（同一个胶上）
  3。最好能纯化你的血清，因为相对于白蛋白MMP太少了。
  4。降低凝胶浓度，7.5%。无论细胞还是血清，都可以
  5。孵育时间延长36h

• www.1 (2013-5-31 11:49:56)

  
  说点个人看法：
  1.血清是加的什么处理液？具体成分？只要不含有使酶不可逆变性的物质就行。
  2.SDS只是使蛋白可逆变性并带上电荷，但并不能使其某一段氨基酸残基水解移除。不建议上样前孵育。更不能高于37度孵，影响酶活性。
  3.如上，加个对照比较好，选已知有较强活性的组织（尤其是肾、肝）或细胞上清。如阳性对照的有活性而样本没有，则可能是血清样本中MMPs活性不够强所致。
  4.如上，延长孵育时间。我一般做36～48h.
  5.改变明胶在胶里的含量。明胶的量决定了背景的深浅。有时背景太深较弱活性的条带不易显示出来。
  6.不知上样buffer的配制如何？另外，上样量是多少（以蛋白量来定）？buffer与样本之间的比例是可调的。本人以前做是 样本：buffer=1:4.因老是不出条带，改用样本：buffer=4:1的比例，惊喜地发现出来了！不过,buffer量少的话，上样时有点飘。
  此外，楼主照相时最好置一玻璃皿内照，清楚一些。看条带时可以胶对着光亮照一下，这样较弱的亮带也能看出来。
  供参考。

• dragonkilly (2013-5-31 11:50:19)

  
  谢谢各位的帮助！
  我做的也是大肠癌的肿瘤细胞，不知道各位细胞上清是如何处理的（我是
  3000转离心10分钟，取上清分装，贮存于－70度），我遇到一个很奇怪的问题，就是有些细胞的上清非常容易出结果，但是有些就是不出结果，我不知道是什么原因，我说的都是同一种细胞的上清，就是不同的药物干预时间，但是肯定是都应该有结果的。
  请大家指导!谢谢！

• 2541 (2013-5-31 11:50:40)

  能告知做明胶酶谱法的具体步骤和所需试剂配方吗?非常感谢!