【求助】如何让蛋白表达到上清中？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-6-01 10:28 作者: qumm1985 来源: 分析测试百科网

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【求助】如何让蛋白表达到上清中？

我用pThioHis-A表达一个细胞因子，宿主菌TOP10，表达量较高，但全部在包涵体中，请问怎样才能让蛋白表达到上清？表达量低一点也没关系，我们这里可以上发酵罐。

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最新回复

3N4G (2013-6-01 10:28:45)

可以考虑改变诱导温度,25度
qumm1985 (2013-6-01 10:29:06)

我尝试过25，27，29，32四个温度，IPTG20ug/ml，也没有作用：（
utt0989 (2013-6-01 10:29:56)

可以试一下在目的蛋白前加一个信号肽！
flower-201 (2013-6-01 10:37:44)

你真么知道你的全部是以包含体存在？对于我的蛋白宝宝我一开始也这样认为。因为我超声处理后使用SDS-PAGE发现上清中没有出现条带，但沉淀很明显。但是我有一个致命的错误就是想当然的认为SDS-PAGE跑不出来就没有。后来大量诱导（200ml-1L）然后浓缩上清，发现部分蛋白宝宝还是可溶的。
lllwwb的方法很对，重要的一点是高菌量短时诱导。
www.1 (2013-6-01 10:38:06)

一般有包涵体的都有少量蛋白漏在上清中，工业化是不是可溶的最好了？那么换一个表达载体行不行？
qumm1985 (2013-6-01 10:43:42)

谢谢各位的指点！
20ug/ml的IPTG应该是很低了吧，25度也试过，不过没有试过高密度短时诱导，我今天试试看。再次感谢！
另外，怎么才算高密度，短时间？多少OD诱导？2小时算不算短时间？
ROSE李 (2013-6-01 10:44:14)

我自己认为是上清还是包涵体与表达的目的蛋白有关，我做过两种蛋白的表达，一种降低温度后诱导会表达，而另一种对条件的改变却很敏感而不表达了。我不知道这是为什么。看来你作低温诱导比较成功，前辈可否介绍一下经验。我还想问一下前辈表达的蛋白中二硫键多不多？谢谢！
qumm1985 (2013-6-01 10:44:38)

“前辈”不敢当，我也没做过多少表达。我目前一般是同一个基因同时连接到不同的载体上，然后分别转化不同的宿主菌，再按常规的方法诱导表达。如果有表达了，再进行优化（大海捞针？只能这样了）其实我的这个蛋白在32度诱导的表达量更高，降低温度只是为了让它降低表达的速度，希望这样能促进折叠，表达到上清，谁知它不听话：（
moonlight45 (2013-6-01 10:45:42)

可以试试诱导温度为18度