【求助】10kd的蛋白western条件

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• 66+77 (2013-6-01 12:23:02)

  
  转膜时间太短，电流有点小。我用biorad的半干转，10V半个钟，或者3mA每平方厘米1.5hrs。特别你的15%的胶，更加难转。还要了解蛋白丰度如何？一抗是否有问题呢？不好说，用构建好的质粒，表达一个，做个阳性对照。还要排除二抗问题。

• 49888 (2013-6-01 12:23:23)

  
  没有做出蛋白条带来，可能原因很多。分析如下：
  1.先拿同实验室战友做出来的蛋白、内参、抗体，从不同角度验证你一套体系（主要是试剂和蛋白样品）是否有问题。
  2.若也能做出来，证明你体系无问题；
  若无法做出来，考虑你的体系中某个环节有问题。假设蛋白样品制备和抗体等均无问题，从电泳、电转步骤即开始查找控制。
  3.电泳后做考染，看看是否有清晰的蛋白条带，根据marker指示辨识。
  4.若未见条带或者条带成团模糊等，则可能是蛋白制备质量问题、蛋白buffer问题、电泳液问题等；
  若可见清晰多条带，证明蛋白提取等步骤无问题，往后做。看电转后，用丽春红染NC膜或PVDF膜，看蛋白是否转上来。
  5.若膜上未见蛋白带印记，考虑电转液问题、电转条件问题等；
  若膜上可见蛋白印记，往后做，完成一二抗孵育，显影等步骤。
  6.根据后面实验情况再调整，也有可能是一抗或者二抗，甚至是牛奶的问题，注意查找原因。当然，到这样问题就简单多了。毕竟标本和蛋白、电泳和电转没有大问题，后面也好解决些。
  你的marker可以转上去，说明电泳电转体系可能没有大的问题。但10KD小分子量蛋白不太好做，尤其要重视蛋白样品制备过程和电转的条件是否合适。
  祝顺利！

• pou (2013-6-01 12:23:54)

  转膜时间太短，电流有点小。我用biorad的半干转，10V半个钟，或者3mA每平方厘米1.5hrs。特别你的15%的胶，更加难转。还要了解蛋白丰度如何？一抗是否有问题呢？不好说，用构建好的质粒，表达一个，做个阳性对照。还要排除二抗问题。
  
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  恒流转一个半小时会不会太长时间了？我看我20分钟的marker已经很清晰了

• pou (2013-6-01 12:26:03)

  
  有没有这种可能：因为机器老化，没能将小分子量的蛋白分离开来，都堆积在上方（比如在30kd处聚集）？

• KGZ564 (2013-6-01 12:26:25)

  有没有这种可能：因为机器老化，没能将小分子量的蛋白分离开来，都堆积在上方（比如在30kd处聚集）？
  
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  可能性不大，如果你觉得这样，那么膜就留大一点。再就是加个阳性对照，带个小标签的，就知道答案了。

• KGZ564 (2013-6-01 12:26:57)

  恒流转一个半小时会不会太长时间了？我看我20分钟的marker已经很清晰了
  
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  不长，你要是不放心，电流可以小点。10KD的蛋白比较小，也没那么难转过去，关键看你的参照是否转过去了。或者你的蛋白浓度太低了，增加上样量都可以解决。目前看不出来是不是转膜的原因，会不会是一抗不好用啊？李春红染不出来经常发生的，特别是重复利用的丽春红。你可以把actin部位的一块染色，actin一般能染出来。

• junhun (2013-6-01 12:27:20)

  
  10KDa的蛋白应选用适用于<20KDa蛋白的PVDF膜，不要使用普通的常规PVDF膜。

• pou (2013-6-01 12:28:12)

  今天10kd分子量的蛋白转膜后，丽春红染色出现清晰条带，估计成功的可能性很大啦！
  半干转：转膜条件是每平方厘米膜1mA，1个半小时。希望对大家有帮助