【求助】Western blot内参actin结果重复不出来

最新回复

• mimili_901 (2013-6-01 16:16:25)

  抗体是否反复冻融了？

• 831226 (2013-6-01 16:17:26)

  
  百分1的封闭液也能用，而且挺好用..
  你用的是湿转吗？膜干了影响不大，还可以用的。
  你把封闭的奶粉换下吧，时间长了就不好用了，也会造成曝光时整张膜发光的。
  我有疑问的是，你前后所做的是否是同一种蛋白？

• 暗香涌 (2013-6-01 16:19:16)

  
  抗体没有反复冻溶，分装了放在4度冰箱里
  用的是湿转，奶粉怕坏了，放了防腐剂
  前后都做的内参actin
  现在天气凉了，会不会有影响，影响抗体结合率什么的

• 暗香涌 (2013-6-01 16:21:12)

  
  我今天又做了，在转完膜后用立春红染了，有条带，说明蛋白应该是转上了，换了10%的脱脂奶粉封闭了2小时，一抗换了一管，1：2000，室温下摇床上摇了1小时，放4度过夜了，明天孵二抗看结果了

• one (2013-6-01 16:21:30)

  
  PVDF不要干了，干了就不好出信号了。
  
  如果你的目的蛋白能杂交出来，说明转膜没问题，那可能就是actin的抗体问题。

• 暗香涌 (2013-6-01 16:23:00)

  
  今天二抗孵了两个小时，还是整张膜亮，也没有条带
  想问一下，现在气温低了，会不会有影响
  急啊，求各位高手解答

• mysmdbl (2013-6-01 16:23:27)

  今天二抗孵了两个小时，还是整张膜亮，也没有条带
  想问一下，现在气温低了，会不会有影响
  急啊，求各位高手解答
  
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  这张膜能杂交出来其他蛋白吗？你的抗体在其他膜上work吗？气温低不是原因，我们实验室夏天穿短袖冻死人照样做得出。

• langlang (2013-6-01 16:23:49)

  
  两次检的样品是否相同？如果不是的话，最好想办法验证下抗体work。
  没有反复冻融，抗体应该不会有问题。
  正常情况下不太可能出现奶粉封闭不充分的情况
  脱脂奶粉最好每次用多少配多少，因为即使加了防腐剂，时间太长也可能会出现沉淀。另外注意使奶粉充分溶解。
  PBST或者TBST的pH值注意下。

• windy+++ (2013-6-01 16:28:04)

  
  PBST的ph值对不？还有，膜一定不要干，除了最后发光。还有，全膜亮很可能是抗体的原因。

• INK (2013-6-01 16:28:34)

  我今天又做了，在转完膜后用立春红染了，有条带，说明蛋白应该是转上了，换了10%的脱脂奶粉封闭了2小时，一抗换了一管，1：2000，室温下摇床上摇了1小时，放4度过夜了，明天孵二抗看结果了
  如果不是抗体的问难，就考虑是不是ECL试剂的问题。