【求助】蛋白分离困扰

最新回复

• tie8 (2013-6-04 10:17:41)

  
  虽然不知道PI，但还是可以尝试用离子交换的吧。反正是尝试，先看一下分离情况也无妨，没准还有发现呢

• xue258 (2013-6-04 10:17:58)

  
  用细长的管子再试试呗 ，一般分子筛需要柱子长，拙见见笑

• abc816 (2013-6-04 10:18:58)

  分子筛的分辨率本身就不高。试试离子交换吧

• bamboo16 (2013-6-04 10:20:08)

  
  跑分子筛是看杂质含量的，如果杂质高于50%，分离效果就不会太好；还有，这目的蛋白是球形还是链形啊，如果是链状分子筛是不靠谱的。不确定PI离子柱也是可用的，选CM和DEAE分别试咯，流穿峰，盐峰挨个筛，最关键的是有标准品什么事都好办

• BOSS2011 (2013-6-04 10:20:35)

  跑分子筛是看杂质含量的，如果杂质高于50%，分离效果就不会太好；还有，这目的蛋白是球形还是链形啊，如果是链状分子筛是不靠谱的。不确定PI离子柱也是可用的，选CM和DEAE分别试咯，流穿峰，盐峰挨个筛，最关键的是有标准品什么事都好办
  
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  跑胶时，泳道顶端的蛋白（推测是aggregation）占50%，50KD和75KD约10%，目标蛋白40%。另外没有标准品啊。谢谢大家的回复。

• S6044 (2013-6-04 10:20:54)

  
  你的几个蛋白分子量差别不是很大，用分子筛效果很定不好，还是考虑离子交换或者疏水吧，你分别用阴离子和阳离子试下然后把流出和洗脱组分都检测下就知道你的PI大概多少了，另疏水层析是不需要知道PI的，疏水和离子的分辨率都是远远高于分子筛的。

• applebook=213 (2013-6-04 10:22:01)

  分子筛的分辨率本身就不高。试试离子交换吧
  
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  分子筛的分辨率不高什么高，常识性错误

• 831226 (2013-6-04 10:23:11)

  
  或者CHT。。。。。。。
  buffer用7.0左右的磷酸盐，这东西碱性蛋白亲和力不错，如果常规离子层析搞不定，试试这个说不定有用

• ROSE李 (2013-6-04 10:24:22)

  分子筛的分辨率不高什么高，常识性错误
  
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  分子筛不是电泳，有—个分离范围，在这个范围内如果蛋白分子量比较靠近，就无法分开一一一我说的是这个意思。这个时候就要用其它的分离手段。如果要找更高的分离手段，可以有亲和层析，高效凝胶柱。其中离子交换能占到目前分离'.纯化的50％任务。

• caihong (2013-6-04 10:25:16)

  
  不同蛋白纯化实验过程中，发觉凝胶柱的纯化效果比离子柱要差。而且凝胶填料装柱的难度要比离子柱高，总是装不好。

• DDD (2013-6-04 10:25:52)

  
  可以用低浓度的胶再跑一遍，看能不能跑下来，确定分子量后再看是不是自己的目标聚体，
  另外你的DTT是不是新配的？

• 49888 (2013-6-04 10:26:24)

  
  根据楼主的描述，样品中可能会有一些聚体存在，用分子筛分离是一种最简单直接的方法。一般分子筛分离需要装填的凝胶高度比较高，如果是高分辨率（小于20微米）的填料可以装填30cm高，负责就需要装填60cm高了，另外分子筛层析对踏板数量有一定要求，G 75填料装填25cm踏板数量肯定是达不到要求的，你的样品中杂带也就不容易分开了。另外还有一个问题就是上样体积问题，上样体积需要为柱体积的1%左右，上样量多了，分离效果也就差了。
  如果你还希望用分子筛分离，建议使用superdex 200 PG装填60cm高，或直接用预装柱。
  另外，你也可以试试离子交换的高分辨率（凝胶颗粒小的）填料。如HP的系列填料。

• c86v (2013-6-04 10:26:49)

  
  同意楼上的，聚体存在的可能性比较大。至于分离，觉得这种情况下，我会优先选择硫酸铵沉淀法。

• am10 (2013-6-04 10:33:42)

  
  分子筛的分辨率不是很高，想取得好的分离效果，需要增加相应的柱高和柱径，即提高理论塔板数来增加分辨率。
  如果能上离子交换柱最好，分辨率会大大提高。阴离子还是阳离子具体情况具体分析，蛋白的PI只能是参考，因为挂柱主要是蛋白质侧链基团，不一定与总PI一致。
  如果有Mono级的柱子，上FPLC，成功率会好很多。

• yes4 (2013-6-04 10:34:45)

  
  如果这么高的柱子也分不开，那再高些可能性也不大。
  建议还是采用离子交换层析（快捷方便，比你的分子筛快多了）或其他的方法。