【求助】重复别人步骤，人家做的目的带强，...

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-6-04 14:06 作者: 麦丽素1986 来源: 分析测试百科网

我是WB新手，最近做刮取细胞总蛋白的SMA（abcam抗体），我自己做了一遍，背景非常脏，隐约看见目的条带，于是让我们实验室的高手帮着做了一次，结果很好，虽然有杂带，但比目的条带弱，曝光时间短点就非常干净。
紧接着我照着她的步骤照搬又做了一次，结果目的条带比杂带弱很多，很难看，如果减少曝光时间，目的条带就显不出来。
她也说不清是什么原因，我很困惑，请各位有经验的高手指点迷津。

我仔细想了一下，唯一的区别是，他用一抗时是新配的，我用的是她这次用剩回收的，可是这种做法应该很正常啊，而且前后差2天而已。

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麦丽素1986 (2013-6-04 14:07:02)

上图是她做的，箭头所示为目的条带，其余为杂带

下面发我做的，箭头所示为目的条带，其余为杂带

24666983.snap.jpg
68943512yao (2013-6-04 14:07:26)

主要在一抗，一抗是回收的就要多孵育一会，延长1h，试试吧。
zsxan1990 (2013-6-04 14:07:47)

这个不应该在抗体的问题上，主要问题还是操作细节上，以及孵育抗体的时间及充分度上，杂带有点多啊
moonlight45 (2013-6-04 14:08:05)

非特异性条带的话主要是应该一抗浓度偏高吧
1、减低一抗浓度
2、减少上样量
3、增加清洗时间或者次数
麦丽素1986 (2013-6-04 14:08:25)

说的有道理，操作熟练度不够，努力去找细节原因！
xingyi08 (2013-6-04 14:08:53)

一直想问你，你和师姐跑电泳的胶浓度一样吗？你的目的条带判断准确吗？
我倒是觉得你做的图上面的两条条带与你师姐做的很像，亮度变化趋势也是一样的（1，4弱，2，3亮）。

90780967.jpg
yueban-1147 (2013-6-04 14:09:12)

我也同意楼上的说法，看带型的话你所标出的你做的目的条带上边的杂条带比较像你师姐做的那个目的条带，你不会真的搞错条带了吧，胶的浓度不同，跑的时间不同条带的高低都是会有变化的
麦丽素1986 (2013-6-04 14:09:32)

呵呵，谢谢大家的回复，胶浓度一样，所有条件都一样，根据marker的位置，就是那个带，继续迷惑