【求助】镍柱纯化wash buffer作用

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• leifengta (2013-6-04 14:13:09)

  
  不会, 6his标签必须要200mM咪唑以上才能洗下来。而杂蛋白对金属离子的亲和性没有那么强，所以用低浓度的咪唑洗几个柱体积就可以去掉了

• mysmdbl (2013-6-04 14:13:42)

  
  那我在网上怎么看见有人用100mM咪唑也能洗下目的蛋白呢？

• leifengta (2013-6-04 14:14:11)

  因为部分蛋白结构比较诡异，6His标签很可能只有3-4个外露
  
  早年有一些10His标签的载体很好用，现在买不到了

• mysmdbl (2013-6-04 14:14:32)

  
  6His标签很可能只有3-4个外露--------------------你的意思是说有3-4个外露的话就会结合不牢固，所以用100mM咪唑也能洗下目的蛋白？假如 6His标签都能结合，则必须用200mM咪唑以上才能洗下来，是这样吗？

• leifengta (2013-6-04 14:20:35)

  是的，当然也和介质本身有关，镍的结合强度就比钴和锌要强

• tangxin_80 (2013-6-04 14:20:57)

  
  你也可以在样品中加一定浓度的咪唑，比如10-40mM的咪唑，这样效果会跟好一些。至于WASH里面的咪唑浓度完全因样品而异，需要多试几个梯度。

• mysmdbl (2013-6-04 14:21:25)

  QUOTE:

  原帖由 tangxin_80 于 2013-6-4 14:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你也可以在样品中加一定浓度的咪唑，比如10-40mM的咪唑，这样效果会跟好一些。至于WASH里面的咪唑浓度完全因样品而异，需要多试几个梯度。

  在样品中加一定浓度的咪唑-----这样可以洗脱更加充分吗？还是什么意思

• dongdongqiang (2013-6-04 14:21:46)

  
  天然的蛋白质中的重复出现的组氨酸、精氨酸、丝氨酸等都和镍离子有一定的结合作用，但是结合能力比较弱，当使用低浓度咪唑（10-40mM）可以消除这种弱结合，这样就可以省去wash buffer洗涤作用，并能得到高纯度目的物了。

• xue258 (2013-6-04 14:22:13)

  你也可以在样品中加一定浓度的咪唑，比如10-40mM的咪唑，这样效果会跟好一些。至于WASH里面的咪唑浓度完全因样品而异，需要多试几个梯度。
  
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  用不同的梯度，应用什么方法检验效果最方便啊？谢谢