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【求助】蛋白大小38kd，western blot结果出在55kd附近
各位高手能否帮我解答这个问题，我要测的蛋白大小是38kd，用的是abcam的一抗，marker是Fermentas家的，同一张膜上做了GAPDH（37kd）和这个蛋白，GAPDH出在36kd下面，目的蛋白出在55kd下面，同份标本跑了两块胶，转了两个膜，也出现这个问题，究竟出现的结果是不是目的蛋白呢？怎么验证？上图是同一张膜，下图是同份标本。O(∩_∩)O谢谢【求助】蛋白大小38kd，western blot结果出在55kd附近
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最新回复
avi317 (2013-6-04 15:06:49)
你好：
55KD位子的条带 有可能是二抗交叉反应造成的，做个二抗对照看看。如果你跑的样品是培养的细胞的话，还有可能是培养基中牛血清在细胞样本处理过程中没有去除干净，也会照成40-67KD位子条带，换个组织样本试试。
standup (2013-6-04 15:07:13)
非常感谢您的回复，我做的是大鼠的脊髓组织，如果是二抗交叉反应造成的，为什么内参没有出现这个问题呢？那这个结果是阳性结果吗？二抗对照是指的不加二抗吗？还是怎么的？O(∩_∩)O谢谢，这是做western blot第一次出现这个问题，之前也没有遇到过。
ero11 (2013-6-04 15:07:39)
建议换个管家蛋白吧。不是非得用GAPDH，用tubulin（50kd），与p38隔得远，这样效果就会好很多了。
你的孵育方法具体是怎样的呢？先孵育p38，再洗掉一抗二抗，再孵育GAPDH吗？
standup (2013-6-04 15:08:07)
你的孵育方法具体是怎样的呢？先孵育p38，再洗掉一抗二抗，再孵育GAPDH吗？
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感谢您的回复，我不是说GAPDH的问题，我先孵育的p38，然后用碧云天家的一抗去除液处理，再孵育GAPDH，我是想问在55kd出来的结果是阳性结果吗？为什么会有这么大的差距呢？说明书说的是38kd的
ero11 (2013-6-04 15:08:35)
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这个不好说。我做的GAPDH在43左右。只能再试试看了。
standup (2013-6-04 15:09:00)
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我知道β-actin的大小是43kd，GAPDH不是37kd吗？redbutterfly (2013-6-04 15:09:23)
要验证条带是否为目的条带，只有通过 konck out 或者knock down.
其实，你可以去质问ABCAM公司的，看他们怎么说。 abcam的抗体单子一般都配套有图，把他们的结果和你的对比下。
standup (2013-6-04 15:09:52)
QUOTE:
我问过了，这是他们给的回复，所以我再试试看看，O(∩_∩)O谢谢你的回复这个abcam的抗体肯定是ok的，做出来的条带很漂亮，抗体不会有问题。
可能的问题有以下几个：
1.可能蛋白处理过程中也会出现这个问题，需要把样品重新处理下，再做下WB.比如如果样品没有完全变性的话，也有可能造成这样的结果。
2如果做出来还是55Kda的话，说明蛋白可能被修饰了，导致分子量有些变化。
3.另外那些标准分子量要在说明书的电泳条件下才能显示正确分子量。用说明书下的电泳条件。
standup (2013-6-04 15:10:11)
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您好，非常感谢您的回复，您说的二抗交叉反应我懂了一些，那二抗对照是不加二抗还是只加二抗呢？O(∩_∩)O谢谢mimili_901 (2013-6-04 15:10:32)
abcam公司抗体说明书一般会写明可以用某种细胞或组织作为阳性对照，如果样品容易得到的话 你可以在做你的样品时外加一个阳性对照看看
standup (2013-6-04 15:11:16)
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一语惊醒梦中人，我又把说明书好好看了看，确实有阳性对照哦，是HepG2，我问问实验室里有没有做的，O(∩_∩)O谢谢55378812.jpg
wmp1234 (2013-6-04 15:12:30)
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就是换一家二抗试试。
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