【求助】SDS-PAGE电泳 HIS系统非变性纯化 单抗制备技术支持

最新回复

• 8princess8 (2013-6-04 15:14:53)

  非变性的HIS标签纯化系统
  
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  您好，首先能否将上述概念讲详细些。另外我想问的是：你们对于含有HIS标签的蛋白可以不经过变性处理上层析柱而分离吗？我们很多时候都是表达的包含体，都得变性处理然后分离纯化。第二，对于得到的目标蛋白，你们是用非变性的SDS-PAGE观察和进行后续实验吗？愿听其详！谢谢！！

• 98776langtao (2013-6-04 15:16:29)

  我整整坐了一年的蛋白纯化及鉴定,虽然单调,但是整个非变性的HIS标签纯化系统及
  SDS-PAGE方法 人鼠杂交瘤单抗的制备方法，俱已经摸所得差不多了，各位战友如
  有相似的问题，可在提出，不要再做无谓的浪费了，时间宝贵。
  本帖子有问必答。当然需要具体点描述你的troubles,这样才好
  回答些，"同时尽量用帖子发，这样会有更多人受益！"－－转引ptglab 的帖子！
  
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  PFPF,偶今后如果要做一定问您老人家了,请多指导!

• 逗号是句号 (2013-6-04 15:16:57)

  您好，首先能否将上述概念讲详细些。另外我想问的是：你们对于含有HIS标签的蛋白可以不经过变性处理上层析柱而分离吗？我们很多时候都是表达的包含体，都得变性处理然后分离纯化。第二，对于得到的目标蛋白，你们是用非变性的SDS-PAGE观察和进行后续实验吗？愿听其详！谢谢！！
  
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  对,不经过变性处理,但是这是基于一定的条件:蛋白质的构想不能太复杂,
  比如说,N段被包埋在三维结构之中,这种一般很难用HIS进行非变性纯化,
  如果想得到此种蛋白的纯品,可考虑换表达系统,如使用YEAST表达体系,
  而如果使分泌型蛋白,可考虑添加信号肽,使用真核瞬时表达体系,一般来讲,
  40KD之下的蛋白,使用HIS系统还是可依的,而且技术还较成熟,简单.至于确定是在
  包含体重的蛋白,完全也可以使用,但是必须如你说的那样,先变性,使6个HIS TAG
  暴露出来,才可以与NI柱结合,当然,肯定影响它的活性,所以如果做功能,就要避开
  使用原核的表达体系,而且,构想特别复杂时,最好也别用此方法.
  第二:我用的时变形及非变性同时检测的手段,砸我现在来说,很明显非变性的条件下,
  出来三聚体的条带,变形条件下,很清楚的一条带.我做的是单体18KD的蛋白,同时后续
  测它的功能,及其单抗,痛苦并快乐着.
  如有不妥之处,非常欢迎提出讨论,

• u234 (2013-6-04 15:18:06)

  我的蛋白分子量<20kd.采用His tag纯化。纯度请见：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/578492')
  
  我纯化的蛋白最终是用的Buffer E: 8 M urea; 0.1 M NaH2PO4; 0.01 M Tris-Cl pH 4.5来洗脱溶解的。这里面有很高的盐离子，不知道我如果想免疫动物制备抗体下一步该怎样处理，是直接免疫动物？还是需要透析盐分。
  
  另外，如果想复性，制成有活性的蛋白（含三个二硫键），有什么建议？
  谢谢！

• junhun (2013-6-04 15:18:28)

  
  我准备做一个植物里的酶，大约53KD，准备用PET32A+是否能纯化出具有酶活性的蛋白？

• www.1 (2013-6-04 15:19:02)

  楼主你好，我也是做了一年的蛋白纯化，但我就很悲催。我表达的是带HIS标签的蛋白，蛋白一直挂不在镍柱上，试过不同的载体，pET-15b 22b 28b 21b 等，我的蛋白的等电点是7.84 ，分子量是57kd，这个问题困扰很久了，不知道该怎么办了？谢谢楼主。

• orangecake (2013-6-04 15:19:18)

  
  我也做了快一年的纯化的，我要测酶活，可溶蛋白表达量很高，可是就是不挂柱，有没有什么好办法啊，不同的离子浓度，PH，双his标签，都用过。不知有什么好的办法啊。

• vivian4123 (2013-6-04 15:19:39)

  您好，我现在在做WB，用抗HIS tag 的一抗，一抗是QIAGEN的，工作浓度是0.1ul每毫升，我想知道我在加一抗的时候，稀释比例是1比多少呢？谢谢了，急用。

• 紫烟 (2013-6-04 15:20:00)

  你好，我想请教你个问题，我使用TAKARA的pCold系统带分子伴侣的，转BL21，构建原核表达载体的，电泳发现蛋白表达在上清，而且浓度也比较高。然后用镍柱纯化，是高浓度的咪唑洗脱下来的。我的下一步实验室是：纯化出来的酶去催化一种底物反应生成另一种产物。（通过HPLC检测底物产物）但我担心高浓度的咪唑会不会影响酶活反应呢？我需要怎么处理吗？透析？还是？？急急急，望楼主尽快回复我好吗？小女子不胜感激了。