【求助】 包涵体如何复性？

最新回复

• 白白的 (2013-6-04 15:44:11)

  
  包涵体的复性主要有两种方式：
  1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释
  2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂
  其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！
  另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次
  你家了多少蛋白呀 ？蛋白量过大也会使复性困难。
  你用的透析代是否是新的，处理过没有？新代有化学杂质！
  最后，有些复性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够用了~~
  
  
  嘻嘻~~~~~祝您好运~！！

• wu11998866 (2013-6-04 15:44:29)

  根据你说的情况，我认为包涵体的复性还要注意以下几点：
  
  1.首先要获得较高纯度的包涵体。
  2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。
  3.透析前后均要离心
  4.透析不能太快.
  5.纯化的最佳条件要摸索。
  
  祝你好运！

• cwcwcww (2013-6-04 15:44:45)

  
  我一直用还原-氧化谷胱甘肽体系复性。稀释复性4度24小时

• qqq111 (2013-6-04 15:45:05)

  
  我来补充几句，但愿有用：
  1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100.
  2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性
  3）复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h
  4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h
  5) 复性率的测定 据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解）

• cwcwcww (2013-6-04 15:45:24)

  
  TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。
  我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。

• fei1226com (2013-6-04 15:46:13)

  请问，如果采用稀释法复性，最后将蛋白浓缩可以吗？
  
  透析法不是耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体吗？

• zhezhe (2013-6-04 15:46:32)

  
  这也是我最大的问题。有没有哪位同仁使用过安玛西亚公司的纯化柱并复性成功的，请发表一下高见。

• www.1 (2013-6-04 15:46:50)

  
  相关疾病：
  头痛
  我用的也是这个纯化系统，可正在摸索中
  头痛啊

• applebook=213 (2013-6-04 15:47:19)

  
  我们实验室采用稀释法在GSH/GSSG中复性48h,透析，过离子交换柱纯化，如果浓度低的话再冷冻抽干。

• 8princess8 (2013-6-04 15:47:41)

  
  本人论文一部分，供参考，蛋白还是不溶解决很EASY,PH10以上便可。
  
  用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。
  渗透休克 用1.2.3方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000 r/min离心0.5 min去上清，加入渗透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1为渗透休克溶液1，V2为培养新鲜菌液），冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，去上清。加V1体积渗透休克溶液2重悬，摇动冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10体积100% TCA (w/v)，涡漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min离心5 min，100 ul丙酮洗涤沉淀，干燥1 h，加V1/2体积1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。
  超声波裂解细菌 渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重悬，冰浴，超声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1 min，然后13000 r/min离心5 min，-20℃保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。沉淀用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司《pET System Manual》提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌100×OD600/3 ul体积加1% SDS溶解，加等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。
  1.2.7重组融合蛋白的纯化
  PrP-pET-32a（+）转化表达菌E.coli BL21（DE3），TB培养基中，25℃，AMP 200 ug/ml，摇床（250 r／min）培养至OD600约为1.5，更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至终浓度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g离心收集菌体。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。
  或使用笔者改进方法，将Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。
  洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，冻干保存。然后12% SDS-PAGE凝胶电泳分析。

• 079777chao (2013-6-04 15:47:59)

  
  说实话,网上蛋白质复性的资料很多,发表的文章也很多,你可以搜索来看看,并且综述好多很好的,我有一篇层析复性的综述,等发表出来就给大家提供

• 9900 (2013-6-04 15:48:17)

  
  包涵体纯化和上游构建有关，别动不动就加Trx融合头。其实包涵体好溶解有时候并不利于纯化，因为你没法做包涵体洗涤步骤。而包涵体在变性的条件下用层析柱纯化（除亲和层析）去除杂蛋白真的很难很难。不知道有那位战友有层析柱纯化包涵体的心得啵，拿出来晒一下。

• www.1 (2013-6-04 15:48:40)

  
  “我原核表达了一个蛋白，发现是以包涵体形式存在。”
  
  我想请教楼主怎么判断以包涵体形式存在？
  我是菜鸟，望大侠指教！

• okhaha (2013-6-04 15:49:13)

  
  我现在用的是稀释复性 在通过离子交换层析 最终反向纯度不是很高