【求助】Ni柱纯化His蛋白 蛋白与柱不结合 柱上复性的建议

最新回复

• 66+77 (2013-6-08 11:36:21)

  跟个贴，我也是新手，说说自己的看法。
  
  你的描述就是蛋白和填料没结合或是结合很弱呗。那可能的原因就太多了。首先，蛋白表达及填料、层析系统的使用是否正确（呵呵，不要生气哦）；其次，我觉得上样时，样品pH调节的是否合适，pH太低结合会弱哦，是否有影响结合的游离氨基酸，是否由于抗氧化剂添加过多导致Ni 2+ 被还原，总之可能性很多啦；最后推荐你好好看看Ni填料的说明书，如果用的是老外的填料，那就更好了，里面的troubleshooting会告诉你很多东西。我们用的QIAGEN的填料，说明书很详细，从表达到纯化都有。

• yes4 (2013-6-08 11:37:24)

  好好学习一下，您说的几个问题很关键，我会核对的，
  另外，我看见有的帖子说，有点蛋白本身不适合Ni柱纯化，不知道这种情况多不多，怎样判断这种情况呢

• vvmmoy (2013-6-08 11:37:52)

  我醯弥灰泶镒龅煤茫诒湫蕴跫拢琀is-tag外露充分，没有什么蛋白不适合Ni柱。当然，蛋白若只在低pH稳定，那也不太适合。
  
  说到组氨酸tag，我又想到一点，不知道你是否在缓冲液中添加了少量的去垢剂，如果没有，可以加2%的triton或是Tween试试，这样可以防止杂蛋白与目的蛋白的interaction。而如果杂蛋白和目的蛋白间由于interaction而附着在一起 ，导致His-tag被掩盖，也会使亲和吸附变弱。
  
  还有一点就是看看填料的颜色。如果发白，就是脱镍了，要是发灰，就是Ni2+ 被还原了。都会使吸附减弱
  
  我想最好能把你做得蛋白的种类，分子量、二级结构等说一下，可能能得到更多的帮助

• hulu呼噜 (2013-6-08 11:38:32)

  
  蛋白分子量：104KD
  培养宿主：BL21(DE3)
  载体 p ET 30a
  包含体裂解液成分：50mM Tris－Hcl Ph8.0
  1 mM EDTA, 100 mMNaCl， 8M 尿素，10 mMDTT， 0.1 mM PMSF
  
  裂解液的pH值是否也要调节到7.4左右呢？

• rxcc33 (2013-6-08 11:38:58)

  Ni柱纯化注意: tris<100mM
  EDTA(EGTA)<1mM
  DTT<1mM
  Triton Tween<2%
  SDS<0.3%
  否则会影响蛋白的结合

• applebook=213 (2013-6-08 11:40:09)

  
  问一下大家谁做过NI柱纯化啊？我也正准备做啊，还没买NI柱啊，哪个公司的好用啊？

• xiaoxiaoniao (2013-6-08 11:40:43)

  蛋白分子量：104KD
  培养宿主：BL21(DE3)
  载体 p ET 30a
  包含体裂解液成分：50mM Tris－Hcl Ph8.0
  1 mM EDTA, 100 mMNaCl， 8M 尿素，10 mMDTT， 0.1 mM PMSF
  
  “1 mM EDTA” 会螯合掉Ni离子；
  “10 mMDTT”会还原Ni离子
  
  裂解液的pH值是否也要调节到7.4左右呢？

• wmp1234 (2013-6-08 11:41:11)

  
  威格拉斯的Ni-agarose就挺好用，有10ml和50ml两种，最近刚用，呵呵！

• wmp1234 (2013-6-08 11:42:51)

  蛋白分子量：104KD
  培养宿主：BL21(DE3)
  载体 p ET 30a
  包含体裂解液成分：50mM Tris－Hcl Ph8.0
  1 mM EDTA, 100 mMNaCl， 8M 尿素，10 mMDTT， 0.1 mM PMSF
  
  裂解液的pH值是否也要调节到7.4左右呢？
  
  ===============================
  
  其实用PBS和8M尿素即可，pH在7.2-7.4

• BOSS2011 (2013-6-08 11:43:12)

  用QIAGEN的填料就不错，他们自己网站上带有说明书，对纯化的步骤出现的问题、原因和解决办法写的很清楚，如果经费不够，国内的闪晶的填料也可以

• plaa (2013-6-08 11:43:34)

  包含体裂解液成分：50mM Tris－Hcl Ph8.0 , 100 mMNaCl， 6M 盐酸胍，0.5 mMDTT就可以了。尿素变性不如盐酸胍彻底，所以标签不暴露，不少人改用盐酸胍溶解样品就可以吸附了，此外你原来裂解液用的EDTA和高浓度DDT都会使镍离子脱落所以挂不上．你再试试吧．应该没问题，此外平衡柱子的缓冲液可以和裂解液差不多，只是去掉0.5 mMDTT，也可以把6M 盐酸胍改８ｍＭ尿素即可，其他都不用变．如果还挂不上，建议换个作用力强的，配基密度大的填料．

• wood533 (2013-6-08 11:44:33)

  
  我觉得是你的蛋白表达量太大,而NI柱载量又太小,给了一个挂不上柱子的假象(和我遇到的问题一样),建议你先做个载量实验

• vivian4123 (2013-6-08 11:45:25)

  
  不同蛋白结构不同，柱上复性时，方法即使一样，结果也会相差很多的 ！