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【求助】WB 不出结果，老师催得紧，愁死人，求助啊
【求助】WB 不出结果，老师催得紧，愁死人，求助啊
各位老师、师兄、师姐，小弟需要用WB来检测ERK等一系列的蛋白的表达变化，前期做的时候有一次（许多次中的一次）是做出来的。后来中间放下了一段时间没有做，最近开始做的时候怎么都做不出来， 压膜 的时候一片白，只有内参特别亮。老师又在后面催得紧。求告诉是怎么回搞啊。
体系是这样的：分享胶12%， 分子量43-60不等，抗体分别来自CST，三叉， ABCAM。内参是来自CST。电泳100V。转膜100V,100分钟。封闭液5%脱脂牛奶+TBST。 一抗二抗都用封闭液稀释（按说明书推荐浓度比如1：1000或者1：200）。
结果：内参强亮，但是有杂带（两条杂带）。目的蛋白处空无一物，白白的。
问题：目的蛋白空无一物可能是什么原因，可以怎么去解决？
内参杂带怎么办？
求求各位帮帮忙！！！谢谢了！！！
另外我想问问，二抗推荐浓度是1：5000，我用的1：8000有问题吗?
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最新回复
yes4 (2013-6-08 11:49:25)
我也是这样 内参出来了 但是目的一片空白呀 丽春红染色有清晰的条带
qumm1985 (2013-6-08 11:50:29)
确保一抗保存得当并且没有任何质量问题吗？切胶时会不会被切掉了？~~~根据maker来切的话有时候也不准的~~~上次我做WB，内参高于对应maker位置6mm左右~~还是很大的偏差了~~~另外可以做一个阳性对照组，如果阳性对照都不出结果那就要考虑抗体问题了~~本人菜鸟，仅供参考
ending (2013-6-08 11:50:51)
现在主要是考虑抗体的问题，切胶时应该不会切掉的，因为我是整个MARKER能显示的地方我都保留下来了，并不是按MARKER显示的分子量大小来切的。阳性对照，就是要买蛋白标准品，这个我感觉不需要吧，因为我们确定蛋白是表达的。RT-PCR已经验证了。
一抗一直放在-20度，应该不是这个的问题吧。
不过现在主要考虑的还是一抗的问题。
yes4 (2013-6-08 11:51:58)
QUOTE:
阳性对照也不一定要买蛋白标准品，找一个确定表达的细胞来做一个组就可以了，也可以用WB抗体说明书上给出的质检时用的细胞来做。一个可以检测抗体效价，另一方面也当给目的蛋白做一个标记，不然到时候maker不准到时候也不好确定那一条是是你要的。ending (2013-6-08 11:52:52)
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谢谢你的再次回复，我们确定 这个是表达的，因为前期有人做过。只是到这里怎么也出不来，今天 我同门又做了一次，看看今天的结果吧。
uuooii (2013-6-08 11:53:36)
用新样品重做。
ending (2013-6-08 11:54:25)
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师兄怀疑是样品的问题？？？和上样缓冲液有没有太大的关系，我这有两个缓冲液，一个是含巯基乙醇的，一个是含DTT的。前者是4度放。后者是-20度放。这两个会有关系吗。
ladyhuahua (2013-6-08 11:55:18)
我也有这个问题过，后来发现是抗体有问题，新和成的就没问题了
ending (2013-6-08 11:56:01)
QUOTE:
最近连内参都做不出来了。愁死了，越急越没有用。不过怎么才能发现是抗体的问题呢。【求助】WB 不出结果，老师催得紧，愁死人，求助啊