【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白

查看完整版本请点击这里:
【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白

我在做原核表达的过程中,使用了pET-28a载体,Rosetta(DE3)表达菌株,但是37℃诱导表达后,连包涵体都没有看到,基本没有任何的蛋白表达,所以想请问一下大家,能不能帮我分析一下是什么原因?谢谢。
PS:我的目的蛋白大量重复序列,是否是由于重复序列导致蛋白在表达过程中无法折叠,如果是这个原因有什么办法可以解决,谢谢。
查看完整版本请点击这里:
【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白

我也来说两句 查看全部回复

最新回复

  • yes4 (2013-6-18 15:37:08)

    我也是用的pET-28a载体,转到BL21感受态细胞中表达,暂时还没有检测蛋白。请问楼主是用什么方法知道你的蛋白没有表达的呢
  • DONT (2013-6-18 15:37:28)


    1、测序,确定读码框无问题
    2、连到真核表达载体上,看看有无表达
    3、有无稀有的氨基酸
    4、表达菌是否有你的质粒所需要的转录表达元件?
    5、诱导试剂是否失效?条件是否合适?
  • lxh031 (2013-6-18 15:37:52)

    我也是用的pET-28a载体,转到BL21感受态细胞中表达,暂时还没有检测蛋白。请问楼主是用什么方法知道你的蛋白没有表达的呢

    ======================================

    SDS-PAGE啊,我跑的全菌,没有见到目的条带。
  • qianqin1977 (2013-6-18 15:38:32)

    1、测序,确定读码框无问题
    2、连到真核表达载体上,看看有无表达
    3、有无稀有的氨基酸
    4、表达菌是否有你的质粒所需要的转录表达元件?
    5、诱导试剂是否失效?条件是否合适?

    ======================================================================================

    谢谢您的建议,但是您所提的5项均没有问题,我跑的是全菌体(上清+包涵体),理论上只要有表达就可以看到条带。
  • qianqin1977 (2013-6-18 15:40:33)

    1、测序,确定读码框无问题
    2、连到真核表达载体上,看看有无表达
    3、有无稀有的氨基酸
    4、表达菌是否有你的质粒所需要的转录表达元件?
    5、诱导试剂是否失效?条件是否合适?

    ==============================================================================

    毕赤酵母真核表达体系正在构建,但是我现在想找出原因分析为什么在原核表达体系中没有任何表达,谢谢。
  • 131415 (2013-6-18 15:41:10)

    你可以用软件预测一下mRNA的二级结构,看看是否是由于重叠序列造成的

    mRNA结构可以使用,RNAstructure,
    cuturl('http://www.bio-soft.net')
    简单方便.密码子的偏爱性,可在翻译以后,人工完成.
    预测RNA二级结构如下进行:
    1. 选择file|RNA fold singlestrand启动模块,单击sequence按键,打开对话框以载入序列,此序列必需以.SEQ为扩展文件名,其它序列文件可在序列编辑器中转为此格式。注意必需为大写字母。
    2. 输入文件名后,缺省值将填充在剩下的区域,这些值可改变。选取 Generate Save File选项,在执行算法后生成存盘文件,此存盘文件用于重新折叠与生成点阵图。
    3. 在此碱基可被强制为单链或双链或螺旋。
    4. 单击开始键,开始预测运算。
    5. 需要的话,选择Draw structure,在绘图模块中看预测的二级结构结果。输出的二级结构以最小自由能顺序排列。但由于方法的限制与热力学参数的简化,第一个结构并不一定为实际的RNA结构,
    要折叠一个已存贮为.seq文件的序列,可选择菜单选项file|fold RNA singlestrand,直接进入折叠窗口。或单击工具条中的fold RNA single strand键。
  • avi317 (2013-6-18 15:44:28)

    会不会是你电泳的问题,电泳缓冲液配错,上样量太小,染色脱色不充分等等。可能是有表达,但是量太少,电泳不可见。WB试试看
  • qianqin1977 (2013-6-18 15:45:40)

    会不会是你电泳的问题,电泳缓冲液配错,上样量太小,染色脱色不充分等等。可能是有表达,但是量太少,电泳不可见。WB试试看

    ===========================================================================================================

    重复几次后电泳没有问题。WB鉴定是有一条非常细的带,但是考染见不到条带,即使WB有条带由于量非常少,也无法用于后续的实验。所以我想请教一下大家,看大家有什么好的建议,帮助我分析一下原因,谢谢。
  • qianqin1977 (2013-6-18 15:46:16)

    你可以用软件预测一下mRNA的二级结构,看看是否是由于重叠序列造成的

    mRNA结构可以使用,RNAstructure,
    cuturl('http://www.bio-soft.net')
    简单方便.密码子的偏爱性,可在翻译以后,人工完成.
    预测RNA二级结构如下进行:
    1. 选择file|RNA fold singlestrand启动模块,单击sequence按键,打开对话框以载入序列,此序列必需以.SEQ为扩展文件名,其它序列文件可在序列编辑器中转为此格式。注意必需为大写字母。
    2. 输入文件名后,缺省值将填充在剩下的区域,这些值可改变。选取 Generate Save File选项,在执行算法后生成存盘文件,此存盘文件用于重新折叠与生成点阵图。
    3. 在此碱基可被强制为单链或双链或螺旋。
    4. 单击开始键,开始预测运算。
    5. 需要的话,选择Draw structure,在绘图模块中看预测的二级结构结果。输出的二级结构以最小自由能顺序排列。但由于方法的限制与热力学参数的简化,第一个结构并不一定为实际的RNA结构,
    要折叠一个已存贮为.seq文件的序列,可选择菜单选项file|fold RNA singlestrand,直接进入折叠窗口。或单击工具条中的fold RNA single strand键。

    ===========================================================================================================

    我通过分析得出了mRNA的二级结构,具体结构见附件,能麻烦您帮我分析一下这个结构么,由于我之前没有学过这方面的知识,对mRNA的二级结构分析不是很了解,谢谢了。


    34830958.snap.jpg

  • 831226 (2013-6-18 16:09:41)


    "WB鉴定是有一条非常细的带",那就证明你的蛋白是有表达的,只不过表达量非常小,你就要优化一下表达条件,因为每个蛋白都是不一样的,所以具体如何优化还要你自己根据蛋白性质进行设计。

    关于你mRNA二级结构,你主要看一下起始密码子aug上游3-10bp处的核糖体结合位点有没有形成双链或发卡,如果有双链或发票、发卡结构,则核糖体不能结合上去,会影响表达效率。
  • qianqin1977 (2013-6-18 16:10:09)

    "WB鉴定是有一条非常细的带",那就证明你的蛋白是有表达的,只不过表达量非常小,你就要优化一下表达条件,因为每个蛋白都是不一样的,所以具体如何优化还要你自己根据蛋白性质进行设计。

    关于你mRNA二级结构,你主要看一下起始密码子aug上游3-10bp处的核糖体结合位点有没有形成双链或发卡,如果有双链或发票、发卡结构,则核糖体不能结合上去,会影响表达效率。

    ===================================

    好的,谢谢!我再仔细分析一下我的蛋白性质。
查看完整回复请点击这里:
【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白