【求助】关于表达量与纯化

最新回复

• lgm (2013-6-19 16:14:50)

  
  如果目的蛋白表达量比较小，可以尝试先用饱和硫酸铵法浓缩蛋白，再进行纯化

• standup (2013-6-19 16:15:27)

  QUOTE:

  原帖由 lgm 于 2013-6-19 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  如果目的蛋白表达量比较小，可以尝试先用饱和硫酸铵法浓缩蛋白，再进行纯化

  非常感谢您的回答！不过硫酸铵沉淀法之前试过几遍，发现目的蛋白沉淀后难以复溶，就没继续下去了。

• lgm (2013-6-19 16:27:41)

  QUOTE:

  原帖由 standup 于 2013-6-19 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  非常感谢您的回答！不过硫酸铵沉淀法之前试过几遍，发现目的蛋白沉淀后难以复溶，就没继续下去了。

  加入低浓度的变性剂不可以么？是怕影响蛋白活性么？下游实验是什么

• standup (2013-6-19 16:37:16)

  QUOTE:

  原帖由 lgm 于 2013-6-19 16:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  加入低浓度的变性剂不可以么？是怕影响蛋白活性么？下游实验是什么

  一般做的都是可溶蛋白，不是包涵体，添加变性剂的方法暂不考虑的。下游准备做抗体，不知道有无影响

• lgm (2013-6-19 16:37:34)

  有的情况下，微量的变性剂可以是蛋白可溶，而且不影响蛋白的活性

• tianmei001 (2013-6-19 16:38:01)

  最近都在纯化带His标签的重组蛋白，发现了一个问题，就是在纯化重组蛋白时候，通常目的蛋白表达量越高，纯化难度就相对越低，相反，若目的蛋白表达量不是很高，纯化起来经常出现杂带与目的蛋白无法分开的现象，经过Ni柱和离子交换，仍无法达到良好的效果。在此想请教各位，碰到表达量不好，目的蛋白与杂蛋白分不开的情况下，该怎么处理？
  附图例一张
  
  ==========================================================================================================
  
  这个是很正常的现象，目的蛋白表达量高，纯化是杂蛋白非特异性吸附则少，得到的目的蛋白的纯度高；相反，如果表达量低，杂蛋白非特异性吸附增加，蛋白的纯度会降低。
  一般 目的蛋白如果在37度是可溶的，那就好做点。就你而言，只是用来制备抗体用，所以也可以从包涵体中纯化得到目的蛋白进行抗体制备。
  从你的帖子及蛋白胶上看，你的蛋白应该是在37度诱导的吧，而且是可溶的，但目的蛋白的下方有3条杂带，这个应该是降解条带（因为，目的蛋白的上方则没有很明显的杂带）。个人的建议就是，整个纯化过程均在4度进行操作；添加蛋白酶抑制剂；如果还不行，那你可以把诱导的温度降到25-30度左右进行诱导，可以提高目的纯化。
  如果以上尝试的有效果，还有一点杂带的话，那你就要优化目的蛋白镍柱纯化的条件，可以适当提高咪唑的浓度（binding buffer）。从蛋白胶看，楼主不是个新手，祝你顺利！

• hold住 (2013-6-19 16:40:15)

  很简单，非特异性结合了嘛，适当增加洗涤液咪唑的浓度就可以了

• taoshengyijiu (2013-6-19 16:41:34)

  
  同意降解带的推论，做抗体用包涵体更省事，很多时候包涵体稍加洗涤就可以达到85%以上纯度，直接不用纯化
  
  这个纯度做抗体够了，不要迷信做抗体的蛋白纯度需要90%以上的说法

• standup (2013-6-19 16:42:05)

  很简单，非特异性结合了嘛，适当增加洗涤液咪唑的浓度就可以了
  
  ==============================================================
  
  我是先用5%浓度咪唑走5个柱长，再用0%~60%线性浓度刷下来的，不过没分开……

• caihong (2013-6-19 16:42:33)

  最近都在纯化带His标签的重组蛋白，发现了一个问题，就是在纯化重组蛋白时候，通常目的蛋白表达量越高，纯化难度就相对越低，相反，若目的蛋白表达量不是很高，纯化起来经常出现杂带与目的蛋白无法分开的现象，经过Ni柱和离子交换，仍无法达到良好的效果。在此想请教各位，碰到表达量不好，目的蛋白与杂蛋白分不开的情况下，该怎么处理？
  附图例一张
  
  ====================================================================================
  
  你好，我要自己做抗体，得先表达蛋白然后再纯化，请问我应该用原核表达还是真核表达呢？具体该怎么操作呢？

• standup (2013-6-19 16:43:02)

  你好，我要自己做抗体，得先表达蛋白然后再纯化，请问我应该用原核表达还是真核表达呢？具体该怎么操作呢？
  
  ===============================================================================================
  
  个人建议用原核表达，至于具体操作方面，一般都是做克隆→转载体→提质粒→转化→诱导→纯化，具体步骤应该容易在网上查到

• langlang (2013-6-19 16:53:15)

  
  50mM, 100mM, 150mM imidazole 去除不純蛋白質
  250 mM imidazole 收集所要蛋白質