【求助】包涵体纯化蛋白 不需要有活性的复性

最新回复

• cwcwcww (2013-6-20 11:03:35)

  
  相关疾病：
  阿尔茨海默病
  补充一下：当初透析后透析袋里有沉淀析出的时候（当时透析液还不浑浊），我将透析袋里的蛋白溶液取出，12000g离心10min，沉淀立即放入-80冻存，上清置于4°C。当时用bradford法分别测定了离心前的溶液和离心后的上清里蛋白含量，离心前的浑浊溶液有明显的蛋白存在，而离心后的上清没有（通过颜色观察）。用过的透析液放置室温，两天后我去观察发现这么大体积的透析液竟然有很多沉淀出来，非常多，bradford测定是没有什么蛋白的。随后我观察了放置4°C的离心后上清液有少量不溶物，我又从-80°取出当时的离心沉淀，分别检测了此时上清跟沉淀中蛋白的存在情况（bradford显色），竟然都没有显色。这究竟是怎么回事？

• junjie05 (2013-6-20 11:04:56)

  
  降低NaCl浓度，加点还原剂如（DDT、2-ME（5mmol/L））看看，4M直接到2M是不是快了点，如果你蛋白疏水性较强的话，可以在透析液中加入20%乙醇看看，个人拙见。

• junhun (2013-6-20 11:07:24)

  
  我又尝试了去掉胱氨酸和半胱氨酸，然后在透析液里加入5%的甘油，尿素梯度变化为8M-4M-3M-2M-1.75M,在1.75M时就出现浑浊。索性不透析，直接超滤管加入PBS超滤，会有蛋白的析出，不过取出浓缩液，离心后上清还是有蛋白的 ，只是比之前少很多。

• mimili_901 (2013-6-20 11:07:49)

  单纯只是增加蛋白可溶性，可以增加甘油含量到30%试试
  但是如果你要加到细胞里面的话，细胞培养液的环境是否适合已经溶解的蛋白？说不定又会沉淀出来
  
  建议把序列贴出来看是否有类似序列成功复性的
  用类似的条件进行复性试试看
  还有可以考虑柱复性试试 ，置换透析液的浓度变化缓慢一点

• mimili_901 (2013-6-20 11:08:24)

  
  ps：高浓度咪唑会影响蛋白浓度测定
  要先排除咪唑对蛋白浓度测定的干扰

• cwcwcww (2013-6-20 11:08:42)

  我尝试了一次可溶性上清部分的纯化，在各种buffer里加了2M的尿素，虽然很多未挂柱，但明显洗下来的蛋白比之前多了很多，（觉得真是HIs被折叠进去了，但我两段都加了HIS ，无语）。将洗脱液（500mM咪唑，2M尿素）收集做透析（20mM Tris，500mM NaCl ，5%甘油，无咪唑，1.75M尿素ph7.9），蛋白仍旧析出。

• 2541 (2013-6-20 11:09:03)

  
  如果对后续试验没有影响，建议复性缓冲液中添加终浓度0.5M的L-精氨酸。

• 33号 (2013-6-20 11:11:05)

  
  复性实在是件能折磨死人的工作。
  个人建议还是在可溶性表达上下功夫，优化诱导条件。低温诱导（18-30℃），IPTG浓度降低。至于咪唑洗脱不下来，可以用EDTA，连NI一块彻底洗脱下来，然后再透析或者脱盐柱处理。

• cwcwcww (2013-6-20 11:11:57)

  
  谢谢各位，我已经在变性纯化后用了PD10脱盐柱去除盐分，成功的将蛋白溶解在了PBS或培养基等溶液中，且没有沉淀的析出。