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【分享帖】当磷酸化遇到 western blot
【分享帖】当磷酸化遇到 western blot
我提出这个话题是因为见到了很多人问到关于磷酸化的问题，我在此抛砖引玉，希望大家在这方面有心得的多谈一谈。看了觉得好可千万不要让它沉了。
①如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
②做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
③检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？
答：可以。
④我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？
答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。
⑤准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？
答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
⑥我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分钟，似乎没什么效果？
答：你可以加巯基乙醇（loading buffer 一样的浓度），56度， 30mins看看。
⑦ 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了。
⑧需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量，但相互间干扰太大，怎么办？
答：将膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巯基乙醇 100mM）中，50℃孵育30分钟，TTBS西三次，再重新加入一抗，进行另一种抗原的检测。
⑨一个分子的磷酸化修饰是否会使这个分子的分子量变大？如果我想要从组织中检测某一蛋白的磷酸化，怎么着手？？？
答：每修饰一处，分子量要变大８０。直接通过SDS-PAGE检测磷酸化前后电泳迁移率变化，蛋白磷酸化后电泳迁移率变慢，可观察到，但与蛋白的性质有关，其被磷酸化的位点多少，前后分子量变化等有关。
⑩磷酸化的western与普通的western有什么不同，具体的操作步骤，注意事项？
答：蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，所以取样品的过程要迅速，样品要新鲜，还有就是最好是新鲜配制的裂解液，裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，okadaic acid 是磷酸酶抑制剂。再者，还要看检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸还要加1um的sodium vanidate 即原钒酸钠 。okadaic acid 中文名为岗田酸，其为磷酸酶抑制剂。其价格不菲，如果考虑价格因素，可以用NaF,NaVO3以及B-甘油磷酸钠来代替。 封闭专用脱脂奶粉：为封闭Immunoblot膜上的蛋白结合位点定制。经过特别工艺去除脂肪，并灭活蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性。蛋白激酶的灭活有利于保护野生型蛋白底物处于非磷酸化状态；灭活蛋白磷酸酶可使已磷酸化蛋白免于去磷酸酶的去磷酸化，因而能维护蛋白的磷酸化状态，为Western Blot提供最佳封闭效果的同时不影响蛋白底物的性质，特别适合蛋白磷酸化和去磷酸化研究。不含添加剂，在室温下能快速溶解于TBS或PBS缓冲液中。
（11）用偏凡酸钠可以代替原凡酸钠？
答：二者不是一个东西，原凡酸钠又名正泛酸钠。可以抑制磷酸酶。从而保护蛋白的磷酸化位点。
（12）关于抗体
答：根据多年经验，不建议买××公司（尤其国内）分装的小包装抗体，省一些钱但经常不能用，目前除了2抗买国产的，一抗倾向于sigma（santa品种很多但不好用；其它R&D等等吧，效价不一定比sigma高，从时间、精力、资金等多方面考虑，最佳性价比是sigma的），磷酸化抗体最专业的是cell signalling。一般抗体的价格都在2000－3000之间。
（13）在stripping后还可以再检测磷酸化蛋白么？
答：可以，但是处理过程要切切注意低温。磷酸化最好放在第一次，除非特别需要
（14）如果要检测某一组织的磷酸化蛋白激酶水平，取材后一定要马上用干冰转移至－80度冰箱保存吗？
答：尽量, 但也不用这麽样, 你要看你的蛋白的性质。
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最新回复
mysmdbl (2013-6-26 17:20:24)
我是一个新手。我的导师要我用SDS-PAGE的方法来得到一种昆虫的蛋白质图谱，给我的蛋白裂解液配方是：
A. 12 g urea, 125L, pH 3–10, IPG buffer (Amersham, Piscataway, NJ)（需购买IPG buffer）, and 16 mL deionized water.
B. 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 75 mM NaCl, 15 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 60 mM _-glycerophosphate, 1 mM NaF, 0.2 mM sodium orthovanadate, 2 mM sodium pyrophosphate, plus a protease inhibitor mixture (Roche Applied Science cat. no. 1836153) （需购买 protease inhibitor mixture）
我觉得配方A似乎不合适，因为我不做2D电泳，而我查资料好像"IPG buffer"是做2D电泳才用得上的。
我查了配方B的各个组分，主要是想知道它们的作用，但都是一知半解的。也不知道到底适不适合我。请大家多多指教！
rxcc33 (2013-6-26 17:20:57)
QUOTE:
50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 缓冲液75 mM NaCl,高盐,可能是溶解作用吧
15 mM EGTA,,Ca离子鳌合剂
1 mM dithiothreitol, 变性
0.1% Tween 20, 非离子表面活性剂
60 mM _-glycerophosphate,防止结晶
自己的理解,能力有限,自己揣摩吧
xue258 (2013-6-26 17:21:49)
最近在做PKC-α的western，但是好多次了都做不出来，会因为做匀浆的时候没有加磷酸酶抑制剂的原因么？
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