【求助】帮忙推荐融合表达载体和分泌表达载体

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• orangecake (2013-6-27 11:14:58)

  
  lz所谓的自行融合蛋白的载体，应该是NEB的intein型载体，包括pTYB系列pMXB和pTWIN
  系列，它们不是自行融合，而是利用蛋白内含子（intein）自动断裂，优点在于可得到不含多余氨基酸的蛋白，去标签时不需要添加任何竞争型底物或者酶，不用做二级处理，还有我个人认为的优点就是纯化基质非常便宜，因为NEB intein型的载体亲和标签是CBD，其亲和基质是几丁质，叫一个价格便宜量又足啊。(关于intein的原理和具体应用lz直接scholar.google.com就一堆东西啊，或者你自己看看NEB的产品说明也很直观啊，信息化社会，坐等不是个事儿啊）
  关于二硫键的问题，关于真核基因原核表达后的活性问题是原核系统表达真核蛋白的最大问题，其实不光包括二硫键，翻译后加工修饰（糖基化等等），肽链的高级结构……都会对活性有影响，做原核系统就是图一个快速大量方便的优点，至于表达出来是否有活性，没得说，尽人事，之后就看神了。目前似乎原核系统对二硫键的问题还是有很多方案，大致就是提高肽链表达修饰环境的还原性，主要包括1、使用OrigamiB等胞质次还原性的菌株（有利于二硫键形成）；2、是周质表达，可能lz提的分泌表达就是这个，事实上周质是细菌的细胞壁的部分，周质表达就是肽链在翻译后被送到胞外的周质完成折叠，注意并没有分泌，由于胞外环境的还原性高，因此有利于二硫键的形成，代表就是NEB的pMAL系列中的p类的载体。这里要提醒lz的是，目前原核系统对二硫键形成的努力只对产物的可溶性有帮助，原核表达的蛋白即使可溶也并不意味着一定有活性，毕竟真核基因表达产物的翻译后加工不是只有二硫键这么简单，加上磷酸化、乙酰化等等表观遗传学的因素，真核基因原核表达的产物活性还是要有一个实验验证才行。
  真核生物的信号肽识别的是内质网-高尔基体-胞膜系统，很显然是不被原核系统识别的。

• 冰岛老叟 (2013-6-27 11:15:20)

  你的回答几乎涵盖了我所有的问题，而且帮我指出新的问题，真的非常感谢！
  感觉您在这方面非常精通，希望可以多多指点。还有个让您见笑的问题，蛋白的内含子是什么？只知道基因的内含子。它自行断裂又是基于什么原理呢？

• 冰岛老叟 (2013-6-27 11:15:47)

  再问一个问题，有没有人总结过所有可以融合表达的载体？还有其中哪些是可以被完全切断的？

• one (2013-6-27 11:16:16)

  你的回答几乎涵盖了我所有的问题，而且帮我指出新的问题，真的非常感谢！
  感觉您在这方面非常精通，希望可以多多指点。还有个让您见笑的问题，蛋白的内含子是什么？只知道基因的内含子。它自行断裂又是基于什么原理呢？
  
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  蛋白质翻译产物在成熟过程中剪切释放出来的一段氨基酸序列称为"intein"--即内含肽.它与前体蛋白以框内融合的形式共同翻译,并内嵌于前体蛋白序列中.
  
  Intein就是蛋白质中的一段序列。它可以从基因的编码区断裂。与内含子不同的是，在翻译后内含肽会通过一种自我催化的蛋白裂解机制从蛋白前体上断裂。
  
  NEB是最早开发内含肽（intein）技术的公司。intein称为“内含肽”，在还原条件下、或者pH值或温度条件改变下会发生N端自剪接，兼有蛋白酶和蛋白连接酶的特性，与内含子在RNA水平自剪接的作用方式相似。
  
  IMPACT表达的目的蛋白通过与蛋白自剪接元件intein，连接几丁质结合蛋白域（CBD）形成融合蛋白，通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白。在特定的条件下，诱导内含肽的肽键裂解活性，将目标蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质纯化介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的。而且，最终得到目的蛋白上不会残留多余的氨基酸。
  
  同时给您一个NEB IMPACT系统的说明书。里边有很详细的介绍。您可以参考一下。见附件（太大了）。
  cuturl('http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE6901.pdf')
  
  另外您也可以登录一下NEB的内含肽数据库InBase。InBase总详细介绍了内含肽的工作原理，罗列了一系列内含肽名称及特性，其中包括了内含肽的原型、活性结构域、发现者名单和参考文献。

• one (2013-6-27 11:18:00)

  再问一个问题，有没有人总结过所有可以融合表达的载体？还有其中哪些是可以被完全切断的？
  
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  各种论坛上都有类似的总结归纳帖。您也可以去一下生物通。生物通有一个专门的原核表达各种标签的总结和比较。还是比较实用的。您可以参考一下。丁香园也有。
  
  cuturl('http://www.ebiotrade.com/newsf/2005-11/2005117153424.htm')
  
  他们有各种专题。应该会有帮助。

• xue258 (2013-6-27 11:18:34)

  最近在做一个9KDa的蛋白的表达，先用pET30a做了表达，因为要用于工业生产没有加任何标签以及多余的氨基酸，结果没有表达。
  看到论坛里说小分子多肽需要融合表达，因为没做过，想请大家推荐一些载体，最好可以把融合标签完全切开的，还有在园子里看到有种可以在改变pH还是温度的条件下自行融合蛋白的载体，很感兴趣，不知道哪位同学可以告诉我载体的名称是什么？非常感谢！
  
  另外，因为要表达的这个蛋白是有二硫键的，据说要分泌表达才可以，请大家介绍几种常用的分泌表达载体。顺便问一下，人源基因本身的信号肽是不是不能被原核表达系统大肠杆菌识别，而被分泌表达？问题比较幼稚，不要笑我哦。
  
  本人在表达方面涉及的面比较窄，希望得到各位高手的帮助，先谢了！
  
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  小分子融合表达还是推荐pET32
  trxA融合标签 有利于提高目标蛋白的表达量、可溶性，还可以促进二硫键的形成
  我们实验室表达的一些列defensin、IGF都是含有二硫键的小分子
  用pET32都能够实现高效功能性表达
  
  此外，估计你蛋白是真核的吧 可能含有很多稀有密码子 推荐用Rosetta系列宿主
  如果有Rosetta gammi就更和谐了，其gorA trxB基因被敲除 胞质成氧化环境
  有利于二硫键的形成
  
  good luck

• 冰岛老叟 (2013-6-27 11:18:57)

  决定先试一下pET32a了。