【求助】creb和p-creb

最新回复

• eric930 (2013-6-28 18:05:41)

  
  首先，应该明确你的蛋白有没有问题，加没有加磷酸酶抑制剂？提取的时候是否注意低温操作？另外上样量是否够？抗体是先孵creb，洗脱液洗完后再孵的p-creb？还是分开孵的？延长抗体孵育时间。

• INK (2013-6-28 18:06:01)

  楼主你抗体浓度好大啊~~ 我最近也在做 没条带 很困惑~

• avi317 (2013-6-28 18:06:41)

  楼主你抗体浓度好大啊~~ 我最近也在做 没条带 很困惑~
  
  =====================================
  
  CREB好做
  但是p-CREB不太好做
  可能是样品没有表达，亦或是抗体的特异性不好
  用过几个p-creb的抗体
  效果都不好

• remenb (2013-6-28 18:07:15)

  CREB好做
  但是p-CREB不太好做
  可能是样品没有表达，亦或是抗体的特异性不好
  用过几个p-creb的抗体
  效果都不好
  
  ===========================================================================================================
  
  我用的是小鼠的海马，可参考的文献并不多，感觉很多条件都试过了，但就是没结果，挺郁闷的。我同时还做了一个14kda的BDNF， 也是没条带，但是actin一直很好，哎~~ 现在正在跟公司投诉呢~~不知道哪里出问题了~~

• avi317 (2013-6-28 18:07:37)

  BDNF本身就不好出条带，这种分泌型的蛋白很少有用做WB吧
  原来我们做的也很不漂亮
  CREB应该是没问题的
  p-CREB不太好选择

• 7437654 (2013-6-28 18:07:59)

  
  我是个新手，要做你们说的比较难做的BDNF和p-CREB，现在在选抗体，没有人指导，很是无助啊。
  我想问个很低级的问题，取的大脑放在﹣80度冰箱中接近一个月，拿出来还可以分离出海马，做western blot 么？
  还有关于抗体的问题，一抗二抗可以分开买不同公司的啊？还要自己买内参么？以前理解的是要买抗体就买的是全套，就是包括一抗，二抗，内参，显色剂全套。

• avi317 (2013-6-28 18:08:23)

  QUOTE:

  原帖由 7437654 于 2013-6-28 18:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我是个新手，要做你们说的比较难做的BDNF和p-CREB，现在在选抗体，没有人指导，很是无助啊。
  我想问个很低级的问题，取的大脑放在﹣80度冰箱中接近一个月，拿出来还可以分离出海马，做western blot 么？
  还有关于抗体的问题，一抗二抗可 ...

  一抗、二抗不同公司都有
  内参当然要
  整个WB是个系统
  需要东西很多，要备齐了

• KGZ564 (2013-6-28 18:08:45)

  
  请问你们现在什么做内参啊？

• wood533 (2013-6-28 18:09:14)

  我是个新手，要做你们说的比较难做的BDNF和p-CREB，现在在选抗体，没有人指导，很是无助啊。
  我想问个很低级的问题，取的大脑放在﹣80度冰箱中接近一个月，拿出来还可以分离出海马，做western blot 么？
  还有关于抗体的问题，一抗二抗可以分开买不同公司的啊？还要自己买内参么？以前理解的是要买抗体就买的是全套，就是包括一抗，二抗，内参，显色剂全套。
  
  ==========================================================================================================
  
  抗体要买还是买好的，p-CREB可以买cell signalling 的，我自己买的抗体没做出来，用同学的（同一公司同一货号）做出来条带非常好，人品不好啊，郁闷~~~bdnf还在摸索中，等做出来再给你建议吧~ 呵呵~
  
  原则上讲这样取海马是能取出来的，但是有两个问题：
  1.当时取大脑是否快速液氮冻存，没有的话估计脑组织都化了，很难将海马取出~
  2.即便取出来了，磷酸化的蛋白估计也降解了不少，在这个取海马的过程中还会降解一些，想做好结果就难了~

• remenb (2013-6-28 18:09:47)

  BDNF本身就不好出条带，这种分泌型的蛋白很少有用做WB吧
  原来我们做的也很不漂亮
  CREB应该是没问题的
  p-CREB不太好选择
  
  =====================================================================================================
  
  我p-CREB出来了，条带很好，问题时BDNF没出，说明书上是14kDa，在坛子里看到同样公司同样货号的抗体竟然有40kDa的，准备试试~

• remenb (2013-6-28 18:10:14)

  我是个新手，要做你们说的比较难做的BDNF和p-CREB，现在在选抗体，没有人指导，很是无助啊。
  我想问个很低级的问题，取的大脑放在﹣80度冰箱中接近一个月，拿出来还可以分离出海马，做western blot 么？
  还有关于抗体的问题，一抗二抗可以分开买不同公司的啊？还要自己买内参么？以前理解的是要买抗体就买的是全套，就是包括一抗，二抗，内参，显色剂全套。
  
  =====================================================
  
  再补充一点啊，除非极不必要，不然就都买国外的东西，国产的质量堪忧~
  

• abc816 (2013-6-28 18:10:42)

  抗体要买还是买好的，p-CREB可以买cell signalling 的，我自己买的抗体没做出来，用同学的（同一公司同一货号）做出来条带非常好，人品不好啊，郁闷~~~bdnf还在摸索中，等做出来再给你建议吧~ 呵呵~
  
  原则上讲这样取海马是能取出来的，但是有两个问题：
  1.当时取大脑是否快速液氮冻存，没有的话估计脑组织都化了，很难将海马取出~
  2.即便取出来了，磷酸化的蛋白估计也降解了不少，在这个取海马的过程中还会降解一些，想做好结果就难了~
  
  一抗二抗分开买是可以的
  
  ===========================================
  
  问一下，从-80度冰箱中拿出脑组织要怎么解冻取海马啊？

• remenb (2013-6-28 18:11:07)

  QUOTE:

  原帖由 abc816 于 2013-6-28 18:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  抗体要买还是买好的，p-CREB可以买cell signalling 的，我自己买的抗体没做出来，用同学的（同一公司同一货号）做出来条带非常好，人品不好啊，郁闷~~~bdnf还在摸索中，等做出来再给你建议吧~ 呵呵~
  
  原则上讲这样取海马是能取出来的 ...

  我没这么干过，我猜组织溶解了以后，海马液化了，你根本取不出来独立、完整的海马，你一定要试的话，冰上取，器械预冷，正常组织你怎么取，现在还怎么取，操作轻柔，尽量少搅动（海马就在皮质下，搅烂后你就分不清哪个是海马了），心里要清楚海马的位置，快速取出海马~ 保佑你吧~ 你要做western的话，取出来后立即放入预冷的蛋白裂解液，超声粉碎，减少磷酸化蛋白的失活~【最好两个人搭档】~~
  
  你取一个先试试吧，要是取不出来就放弃吧，海马本来就应该在处死后立即取出的~而且取闹的时候有没有迅速液氮冻存影响也很大~
  

• glass (2013-6-28 18:11:32)

  
  CREB&p-CREB CST的 1:500 二抗 HRP抗兔 碧云天1:2000.
  本人都是现杀现取海马（SD大鼠） 保证新鲜！没有冻存后在取的，而且最好是取完直接匀浆测蛋白。
  核蛋白的提取按照碧云天试剂盒提取 匀浆液（蛋白裂解液）中 现用现配加入蛋白酶的抑制剂和naF。本人做出来的结果是，纯核蛋白不如胞浆胞核（超声粉碎的方法）一起跑的结果好。
  wb 没有内参 你发表一个文章试试。

• glass (2013-6-28 18:12:17)

  
  转膜300mA 根据你的带子面积 时间我觉得偏长。50即可 60问题也不大吧

• bling (2013-6-28 18:12:38)

  
  只能求老天保佑了，不然标本都浪费了，可惜啊！

• vivian4123 (2013-6-28 18:12:58)

  
  请问检测大鼠肺血管内皮细胞中PKA活性，我选择了P-CREB这个底物行western-blot，内参应该选什么呢

• avi317 (2013-6-28 18:13:31)

  我p-CREB出来了，条带很好，问题时BDNF没出，说明书上是14kDa，在坛子里看到同样公司同样货号的抗体竟然有40kDa的，准备试试~
  
  ====================================
  
  问一下你的p-creb抗体货号多少？哪个公司的？