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【求助】做wb，蛋白是270k，转膜效果不好

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-7-01 17:43    作者: 30moonriver    来源: 分析测试百科网

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【求助】做wb，蛋白是270k，转膜效果不好
做wb，蛋白是270k，用6%的分离胶跑，然后80v湿转1.5h。结果用考马斯亮蓝染胶，用立春红染膜后发现膜上蛋白很少，胶上也没什么蛋白。在转膜缓冲液里放了SDS。不知道为什么。
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  • BOSS2011 (2013-7-01 17:43:34)


    首先你的蛋白上样量是多少，可以再跑完胶后直接染色看看，而且我想270的蛋白8%的脚比较好，你转膜的时间有点短，100V2.5h我想比较合适，另外如果BUFFER不对，一定是不行的，转膜效果可以根据蛋白marker的转膜效果直接判断。

  • mimili_901 (2013-7-01 17:44:06)

    试一下低温过夜转。

  • 30moonriver (2013-7-01 17:44:25)


    上样量是50ug，那在buffer中该不该加sds呢？我在转小分子量蛋白的时候没加

  • 2541 (2013-7-01 17:45:25)


    分子量270kd本来就是很难电泳转膜的，太大，上样缓冲液里SDS是必须加的，转膜缓冲液也应该有SDS,宝生物的产品目录上推荐的配方2.9g甘氨酸，5.8gtris,0.37gSDS，分子克隆上湿法转移的配方是48mmol/L Tris碱，39mmol/L甘氨酸，20%甲醇，0.0375%SDS,半干转移的配方是24mmol/L Tris碱，192mmol/L甘氨酸，20%甲醇。转移效率受SDS、pH值影响，SDS浓度不应高于0.1%,pH不低于8.0。
    270KD的胶应该用8%的分离胶，甚至更低（分子克隆上200以上的推荐5%，够低吧），转膜的时候可以试试恒流300-400MA转2个小时。

  • sunnyB (2013-7-01 17:45:46)


    砖膜的时间太短了，我习惯250mA 转3-3.5小时（280KD的蛋白），效果不错

  • 30moonriver (2013-7-01 17:46:15)


    分子量273KD
    分子量265KD
    分子量120KD
    转膜条件是什么啊？

  • jrwyyplt (2013-7-01 17:46:34)


    265kd和273kd的最好是转膜过夜，甲醇浓度15%，不知道你用什么仪器，你可以试着摸摸低电流或者低电压过夜，效果会好些，同时要考虑你的蛋白表达丰度，即上样量的要求。如果有文献支持就最好了，仅供参考。

  • 30moonriver (2013-7-01 17:46:57)


    学习了
    我的分子是168的 请问伯乐的湿转什么条件好
    转膜液什么配方好

  • langlang (2013-7-01 17:47:16)


    第一次听说转膜缓冲液加SDS的，请问原理是什么？

  • bs4665 (2013-7-01 17:47:48)

    我做的分子量是289kd的mtor蛋白，湿转和半干转都没问题。

    12%的胶即可，因为我还要跑其他蛋白。
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