【求助】亲和层析操作

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• rxcc33 (2013-7-02 16:57:18)

  首先你要确定你的目的蛋白是表达在上清还是沉淀，若是沉淀需进行复性，如果是上清表达的，则可按以下步骤操作：
  1、细菌破碎（可以超声波、溶菌酶等方法）
  参考（超声波方法：工作5.5秒，停9秒，10min/次，功率25%，2-3次）， 具体视破菌效果而定。
  2、离心取上清。
  3、在破菌的过程中你可以填装或者再生你要使用的层析柱，如Ni柱。
  4、层析柱平衡。
  5、上样
  6、洗脱
  7、电泳检测

• yysr238 (2013-7-02 16:58:23)

  我要确定目的蛋白是表达在上清还是沉淀，是不是可以通过细菌破碎，离心再sds-page分别分析上清和沉淀？
  有战友知道复性的相关操作（最好包括试剂的配制），请和我分享下。
  另外在5上样和6洗脱方面，操作上有没有什么注意的要点，上样是不是把2上清液倒入即可（我的柱子是预装柱），因为我没有看人做过，还一头雾水。
  希望大家能都都帮忙！谢谢！

• wmp1234 (2013-7-02 16:58:50)

  要判断你的蛋白是沉淀还是上清用你的方法是可以的。
  上样之前最好过滤一下你的上清避免没有完全沉淀的碎片堵塞柱子，加上清也是要缓慢加入，用蠕动泵之类的，压力不能太大。
  洗脱的时候可以采用分步的方法。
  关于复性的问题很复杂，可以搜一搜相关的帖子。

• mysmdbl (2013-7-02 16:59:16)

  随便找个说明书,或看分子克隆写的很清楚.

• yueban-1147 (2013-7-02 17:00:06)

  
  复性我们直接把纯化的蛋白样品加到复性缓冲液里，4度摇2天后过滤
  复兴缓冲液
  Tris-CL EDTA 谷胱甘肽氧化型及谷胱甘肽还原性 再加PMSF
  具体浓度我没记，等下我再去实验室瞅下

• abc816 (2013-7-02 17:00:53)

  我检测了我的蛋白，很不幸形成包涵体了，要做复性，可不可以把复性缓冲液里得具体配方告诉我下，谢谢！

• yysr238 (2013-7-02 17:01:46)

  
  我接下来要做包涵体纯化和复性。
  我纯化的蛋白是用来做EMSA的（很奇怪我找不到这方面的资料），而看到的文献都是用提取的核蛋白做的，实验是老师设计的，我的英文阅读水平挺烂的，看的外文文献不多，如果有这方面的文献，请告诉我下。
  我想问这样的方法是否可行！

• yysr238 (2013-7-02 17:02:06)

  复性后如何知道蛋白复性成功，如何知道蛋白质具有活性。
  我的蛋白不是酶